張 偉，宋 靜，王艷凱，翁儼玫，胡玉欽，劉建芳

鹽酸二甲雙胍是雙胍類降血糖藥，因其療效確切，不良反應較小，廣泛應用于2型糖尿病的治療，是治療糖尿病藥物中最經濟的品種之一，也是多個國家糖尿病治療指南中推薦的控制高血糖的一線用藥和聯(lián)合用藥中的基礎用藥［1-6］。目前國內已上市的鹽酸二甲雙胍單方制劑就有100多種，且包括普通片、腸溶片、腸溶膠囊、緩釋片等多種劑型。其中腸溶制劑的開發(fā)是為了減輕鹽酸二甲雙胍的胃腸道刺激［7］，而緩釋制劑的開發(fā)則是為了減少服藥次數(shù)［8］。但是由于二甲雙胍的體內吸收位置比較局限，主要集中在小腸上部，腸溶制劑和緩釋制劑體外釋放特征的改變是否影響藥物的生物利用度值得考慮。國外有研究應用Gastro PlusTM軟件模擬具有不同釋放速率的鹽酸二甲雙胍制劑的體內吸收特征［9］，得出體外2 h內完全釋放的鹽酸二甲雙胍制劑生物等效的結論，認為無需再做體內試驗。研究結果提示，鹽酸二甲雙胍腸溶制劑和緩釋制劑的生物利用度可能不如普通速釋制劑。國內有研究表明，符合體外溶出度檢查標準的鹽酸二甲雙胍普通片盡管在溶出曲線方面存在差異，但體內吸收可能一致［10］;而鹽酸二甲雙胍腸溶片雖然也滿足藥典溶出度檢查標準，但體內吸收卻不一定一致［11］。本研究基于上述文獻報道結果，選擇4種具有不同體外釋放特征的鹽酸二甲雙胍制劑，首先測定各制劑的體外釋放情況，然后以鹽酸二甲雙胍片(A)為參比制劑，考察了一種鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊(B)和兩種鹽酸二甲雙胍緩釋制劑(C、D)在比格犬體內的生物等效性。

1 材料

1.1 藥品與試劑 參比制劑A:鹽酸二甲雙胍速釋片(中美上海施貴寶有限公司;規(guī)格:0．5 g;含量:101．2%;批號:20110904);受試制劑B:鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊(北京圣永制藥有限公司;規(guī)格:0．25 g;含量:99．4%;批號:20110864);受試制劑C:鹽酸二甲雙胍緩釋片(印度 USV LIMITED公司;規(guī)格:0.25 g;含量:102．4%;批號:28009826);受試制劑D:鹽酸二甲雙胍緩釋片(悅康藥業(yè)集團有限公司;規(guī)格:0．25 g;含量:99．2%;批號:100602)。鹽酸二甲雙胍對照品(以C4H11N5·HCl計，純度為100%，中國食品藥品檢定研究院，批號:100664-200602);乙腈為色譜純(天津市康科德科技有限公司);十二烷基硫酸鈉(SDS)為Amresco公司產品;超純水，HealForce超純水儀制備;其他試劑均為分析純。空白血漿來自于健康比格犬。

1.2 儀器 UV-754紫外可見分光光度計(上海第三分析儀器廠);RCZ-8M智能溶出實驗儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司);Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司);BP-211D型1/10萬電子天平(德國Sartorius公司);HealForce PWVF型超純水儀(上海市Canrex分析儀器有限公司);TARGIN VX-Ⅱ渦旋儀(北京市踏錦科技有限公司);TG 16-WS臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

1.3 動物選擇 12只健康成年比格犬(青島博隆實驗動物有限公司，合格證號:0016573)，雌雄各6只，質量12～15 kg，近2個月內未進行其他藥物試驗。試驗方案經解放軍白求恩國際和平醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

2 方法

2.1 體外溶出試驗 按照《普通口服固體制劑溶出度試驗技術指導原則》［12］及鹽酸二甲雙胍各制劑質量標準項下的相關要求，采用2010年版《中華人民共和國藥典》［13］溶出度測定(附錄XC)第一法裝置，對待測制劑進行溶出曲線測定。其中參比制劑A以磷酸鹽緩沖液(pH 6．8)1000 ml為溶出介質，分別于5、10、15、30、45 min、1、1.5、2 h 取樣測定;受試制劑B先以0．1 mol/L鹽酸溶液750 ml為溶出介質，經2 h取樣后，在各溶出杯中加入預熱至37℃的0．2 mol/L磷酸鈉溶液250 ml，混勻，調節(jié)pH值至6．8，于5、10、15、30、45 min 取樣測定;受試制劑 C和D以磷酸鹽緩沖液(pH 6．8)1000 ml為溶出介質，分別于 5、10、15、30、45 min、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h取樣測定。上述樣品均采用紫外分光光度法測定二甲雙胍的濃度，并計算累積溶出度。

2.2 犬血漿中二甲雙胍濃度的測定

2.2.1 色譜條件:分析柱為北京迪馬科技有限公司的Diamonsil C18色譜柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm)，保護柱為安捷倫公司的 XDB-C18柱(20 mm×4．6 mm，5μm);流動相為乙腈－10 mmol/L磷酸二氫鈉水溶液(含 4 mmol/L SDS，36∶64)，流速為1．0 ml/min;柱溫為30℃;檢測波長為233 nm;進樣體積為20μl。

2.2.2 血漿樣品預處理:取比格犬血漿樣品200μl，置2 ml塑料試管中，加入20μl高氯酸溶液(30%，w/v)，渦流 2 min，離心 5 min(12 000 r/min)，吸取100μl上清液置進樣瓶內，待測。

2.2.3 方法學考察:依據(jù)生物樣品分析方法確證要求［13-14］，對所建犬血漿中二甲雙胍測定方法進行了全面的驗證。通過犬空白血漿、空白血漿含10μg/ml二甲雙胍對照品的質控樣品和比格犬服用鹽酸二甲雙胍片后的血漿樣品色譜圖(圖1)，可見二甲雙胍的保留時間約6．0 min，血漿中內源性雜質不干擾測定;該法的線性范圍為 0．1 ～50．0 μg/ml，定量下限為 0．1 μg/ml;用3 個濃度質控樣品(0．2、2．0、40．0μg/ml)考察日內、日間精密度，相對標準偏差(RSD)均 ＜7．2%，相對偏差(RE)為 1．5% ～4.3%;平均提取回收率為92．4%;二甲雙胍血漿樣品室溫放置8 h、經歷3次凍融循環(huán)及冷凍儲存30 d，以及血漿樣品處理后置自動進樣器放置24 h，結果都在測定誤差內，表明二甲雙胍血漿樣品在考察條件下穩(wěn)定，滿足犬血漿中二甲雙胍測定要求。

圖1 比格犬血漿中鹽酸二甲雙胍測定方法專屬性色譜圖A．空白血漿;B．含二甲雙胍10．0μg/ml血漿樣品;C．服鹽酸二甲雙胍片2 h后血漿樣品

2.2.4 血藥濃度測定:方法驗證通過后測定比格犬血漿樣品。為確保未知樣本測定的結果準確可靠，在測定過程中進行質量控制，每個分析批隨行測定均勻分布的質控樣本。

2.3 生物等效性研究

2.3.1 給藥方案及血樣采集:采用DAS2．1．1軟件提供的四制劑簡化四交叉試驗設計，將12只健康比格犬隨機分為4組，于4個周期交叉服用A、B、C和D四種制劑，清洗期為7 d。比格犬在試驗前禁食10 h過夜，第2天清晨用20 ml溫水灌服參比制劑或受試制劑500 mg，4 h后統(tǒng)一進食。于服藥前(0 h)和服藥后 15、30、45 min、1、1．5、2、2．5、3、4、6、8、10、12、24 h 于后肢靜脈取血約 4 ml置于肝素化試管中，3000 r/min離心 10 min，取血漿，置于－20℃冰箱中保存?zhèn)錅y。

2.3.2 藥動學參數(shù)計算和生物等效性分析:根據(jù)所測血漿中二甲雙胍的濃度，采用DAS 2．1．1軟件，基于非房室模型方法，計算比格犬空腹口服A、B、C和D四種制劑500 mg后不同時間血漿中二甲雙胍的主要藥動學參數(shù)和3種受試制劑相對于參比制劑的平均相對生物利用度。將藥物濃度－時間曲線下面積(AUC0-t)、AUC0-∞和Cmax經對數(shù)轉換后進行方差分析和［1－2α］置信區(qū)間分析，評價3種受試制劑與參比制劑的生物等效性;生物等效標準為受試制劑與參比制劑的 AUC0-t、AUC0-∞和 Cmax幾何均值比的90%置信區(qū)間分別為80% ～125%、80% ～125%和75% ～133%［10］。tmax采用配對 Wilcoxon法檢驗，但不作為判斷生物等效性的重要指標。

3 結果

3.1 鹽酸二甲雙胍制劑體外溶出度 鹽酸二甲雙胍普通片在45 min內溶出度達到標示量的100.1%，符合2010版《中華人民共和國藥典》要求(高于標示量70%);鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊在0．1 mol/L鹽酸中2 h釋放量平均為1．09%(低于標示量的10%)，pH 6．8磷酸鹽緩沖液中45 min釋放量平均為100．2%，符合2010版《中華人民共和國藥典》要求(高于標示量的80%);鹽酸二甲雙胍緩釋片24 h內平均累計溶出百分率為97．5%，具有明顯的緩釋特征。

3.2 血藥濃度－時間曲線及藥動學參數(shù) 在試驗的第2周期，1只犬服用腸溶膠囊時出現(xiàn)嘔吐現(xiàn)象，采血中斷，故平均藥動學參數(shù)計算采用11只犬的數(shù)據(jù)。兩種二甲雙胍緩釋片相對于二甲雙胍片的tmax明顯延長，Cmax明顯降低;二甲雙胍腸溶膠囊的達峰時間與緩釋制劑相似，峰濃度介于速釋片和緩釋片之間。見表1、圖2。

表1 11只健康成年比格犬口服4種鹽酸二甲雙胍制劑后主要藥動學參數(shù)(x±s)

圖2 11只健康成年比格犬口服4種鹽酸二甲雙胍制劑后平均血藥濃度－時間曲線A．鹽酸二甲雙胍片;B．鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊;C．鹽酸二甲雙胍緩釋片(進口);D．鹽酸二甲雙胍緩釋片(國產)

3.3 生物等效性 以AUC0-24h計，受試制劑B、C、D相對于參比制劑A的平均相對生物利用度分別為(85．72 ±32．84)%、(63．65 ±17．59)%和(71．52 ±16．46)%。藥動學參數(shù)90%置信區(qū)間，與參比制劑A相比，制劑 B、C 和 D 的 AUC0-24h、AUC0-∞90%置信區(qū)間均不在參比制劑的80% ～125%范圍內，Cmax90%置信區(qū)間均不在參比制劑的75%～133%范圍內，表明制劑B、C、D與制劑A之間均不具有生物等效性。見表2。

4 討論

4.1 血樣測定方法的選擇 由于鹽酸二甲雙胍極性較大，在反相色譜柱上不易保留，一般采用流動相中添加離子對試劑的方法延長保留時間，常用的離子對試劑有庚烷磺酸鈉［15］和十二烷基硫酸鈉。本文使用了后者，通過調節(jié)離子對試劑濃度和有機相比例，確定了良好的色譜分離條件，血漿中內源性物質無干擾。文獻報道二甲雙胍血漿樣品的處理方法多是沉淀蛋白法，曾嘗試采用多種沉淀蛋白劑，以乙腈、甲醇等為蛋白沉淀劑時，由于稀釋倍數(shù)多，檢測限較低，最終選擇30%高氯酸沉淀蛋白，分離效果和檢測靈敏度均達到測定要求。

表2 3種受試制劑與參比制劑生物等效性結果

4.2 體外溶出度 體外溶出度結果表明，受試制劑B、C、D和參比制劑A均符合各制劑項下有關溶出度檢查標準。但鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊(受試制劑B)在0．1 mol/min酸中的溶出度雖然符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定的合格標準，即2 h內釋放量不得大于標示量的10%，但是片間差異較大，其在pH 6．8的緩沖液中溶出度也符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定的合格標準，即釋放量不得低于標示量的80%，片間差異較小。進口和國產緩釋制劑溶出曲線相似，相似因子f2為59．2，藥物在體外緩慢釋放，24 h釋放完全。

4.3 生物等效性 鹽酸二甲雙胍屬于生物藥劑學分類系統(tǒng)(BCS)Ⅲ的藥物，具有高溶解性、低通透性的特點［16］;口服鹽酸二甲雙胍后其在胃腸道的吸收不完全，主要在小腸吸收，胃和大腸對其吸收甚微，用藥后6～10 h時吸收幾乎停止，平均絕對生物利用度約55%［17］。因此，二甲雙胍制劑在吸收部位的濃度及停留時間會影響其體內吸收。生物等效性研究結果顯示，3種受試制劑相對于參比制劑A均不等效，其中緩釋制劑tmax明顯延長，Cmax明顯降低，但生物利用度明顯不如普通片劑，是否影響治療效果還有待臨床研究。

［1］ 蘇宏，孫萌萌，趙躍萍，等．二甲雙胍對2型糖尿病患者血漿C反應蛋白和血脂水平影響［J］．臨床誤診誤治，2014，27(6):96-98．

［2］ 席軍，黃桂華．鹽酸二甲雙胍緩釋制劑研究進展［J］．中國醫(yī)藥科學，2011，1(6):36-37．

［3］ Setter SM，Iltz J L，Thams J，et al．Metformin hydrochloride in the treatment of type 2 diabetes mellitus:a clinical review with a focus on dual therapy［J］．Clin T-her，2003，25(12):2991-3026．

［4］ 王偉東．5種藥物治療2型糖尿病的成本－效果分析［J］．實用醫(yī)技雜志，2006，13(11):1864-1865．

［5］ 楊長衛(wèi)，馬鵬飛，張建祥．二甲雙胍對2型糖尿病大血管病變的防治研究進展［J］．臨床誤診誤治，2014，27(1):107-111．

［6］ 吳乃君，金秀平，盛佳曦，等．二甲雙胍對胰島素抵抗狀態(tài)下脂肪細胞的作用［J］．中國醫(yī)藥，2014，9(1):66-69．

［7］ 楊莉，趙志剛．對某國產鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊溶出度的評價研究［J］．藥品評價，2014，11(2):28-32．

［8］ 梅勇，李興東．國產鹽酸二甲雙胍緩釋片與美國fortamet(R)緩釋片體外釋放度的對比研究［J］．臨床合理用藥雜志，2012，5(15):18-19．

［9］ Crison J R，Timmins P，Keung A，et al．Biowaiver approach for biopharmaceutics classification system class 3 compound metformin hydrochloride using in silico modeling［J］．J Pharm Sci，2012，101(5):1773-1782．

［10］張丹，楊漫，張婭喃，等．鹽酸二甲雙胍片上市后人體生物等效性再評價［J］．中國藥學雜志，2013，48(9):725-729．

［11］張丹，楊漫，韓靜，等．鹽酸二甲雙胍腸溶片上市后人體生物等效性再評價［J］．中國藥學雜志，2012，47(18):1565-1569．

［12］國家食品藥品監(jiān)督管理總局．《普通口服固體制劑溶出度試驗技術指導原則》［EB/OL］．［2015-02-05］．http://www．sda．gov．cn/WS01/CL0087/114286．html．

［13］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(2010年版)［K］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:85-86，194-199．

［14］ Viswanathan CT，Bansal S，Booth B，et al．Quantitative bioanalytical methods validation and implementation:best practices for chromatographic and ligand binding assays［J］．Pharm Res，2007，24(10):1962-1973．

［15］李藝，陳峰杰，張良珂，等．HPLC測定鹽酸二甲雙胍腸溶片的含量［J］．光譜實驗室，2011，28(6):3235-3238．

［16］ Blume H H，Schug B S．The biopharmaceutics classification system(BCS):ClassⅢdrugs-better candidates for ba/be waiver?［J］．Eur J Pharm Sci，1999，9(2):117-121．

［17］ Graham GG，Punt J，Arora M，et al．Clinical pharmacokinetics of metformin［J］．Clin Pharmacokinet，2011，50(2):81-98．