楊成煥 楊 姚 李 闊 王靜靜 姚婭婷 張 田 王敏康

云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心（昆明，650500）

以往的研究發(fā)現(xiàn)蕓豆植物凝集素（PHA）可抑制受精、抗著床［1－2］、影響胚胎發(fā)育并具有終止妊娠作用［3－4］。同時還具有明顯的抗人免疫缺陷病毒作用［5－6］。隨著對其各方面的深入研究，越來越多的證據(jù)顯示其在生物、醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用價值。相關(guān)研究表明在終止妊娠方面，紅蕓豆PHA是通過直接與子宮和胎盤接觸而發(fā)揮作用，但其終止妊娠作用是以何種途徑實現(xiàn)尚不清楚。胎盤是連接母體與胎兒的重要器官，對妊娠的維持具有重要作用。本實驗通過對紅蕓豆PHA導(dǎo)致流產(chǎn)的小鼠胎盤進(jìn)行顯微形態(tài)學(xué)觀察、DNA提取與電泳以及胎盤與子宮8－異前列腺素F2α（8－iso－PGF2α）的檢測，以了解紅蕓豆PHA在終止小鼠妊娠時對胎盤的形態(tài)和功能的影響，為研究紅蕓豆PHA終止妊娠機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

紅蕓豆PHA，由本實驗室從紅蕓豆（Phaseolus vulgaris Linnaeus）中提取并進(jìn)行濃縮。用于注射的PHA含0.8%氯化鈉，使用前用PBS配制成所需的濃度。注射用血清促性腺激素（PMSG），杭州動物藥品廠，生產(chǎn)批號：140102；注射用人絨毛膜促性腺激素（hCG），杭州動物藥品廠，生產(chǎn)批號：140214；動物組織基因組（DNA）提取試劑盒為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)，貨號：CW0546；小鼠8－異前列腺素 F2α（8－iso－PGF2α）ELISA 試劑盒、甲基綠、派諾寧Y均購于上海源葉生物科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（TUNELPOD），上海七海復(fù)泰生物科技有限公司，貨號：AP005－3；DAB顯色試劑盒，北京索萊寶科技公司，貨號：DA1010；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。TGL－168高速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器。

1.2 實驗動物

健康昆明白小鼠，體重25～28g，購于昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。室溫21～25℃飼養(yǎng)，12h光照，12h黑暗，自由攝食與飲水。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物處理及取材 對性成熟雌鼠進(jìn)行超排卵處理：下午6：00皮下注射PMSG，劑量為5U／只，48h后腹腔注射hCG，劑量為5U／只。然后與雄鼠按2∶1合籠，次日見栓者為妊娠第1天。于妊娠第14天給藥，分為PHA和PBS兩組，每組40只。再按不同時間處理段分為4個小組，每小組10只。給藥方式為非手術(shù)法經(jīng)陰道單側(cè)子宮單次注射。PHA組注射紅蕓豆PHA 5mg／只。PBS組注射PBS，0.05ml／只。分別于注射后2h、5h、8h和24h或看到流產(chǎn)現(xiàn)象時對小鼠進(jìn)行斷頸處死，分離子宮并除去胎鼠，取子宮段和胎盤分別勻漿，3000g離心10min，取上清用于測定8－iso－PGF2α，一部分子宮和胎盤保存于－20℃冰箱，用于DNA提取，剩余部分用中性甲醛固定，4℃冰箱保存。

1.3.2 子宮、胎盤染色及DNA提取 ①子宮臺盼藍(lán)染色：分別于注射后2h、5h、8h和24h或看到流產(chǎn)現(xiàn)象時對小鼠進(jìn)行斷頸處死，經(jīng)子宮角注射0.5%臺盼藍(lán)，使子宮充滿，10min后分離子宮并用PBS洗去多余臺盼藍(lán)，去除胎兒，保留子宮和胎盤部分觀察。②孕鼠子宮及胎盤核酸電泳：?。?0℃保存的孕鼠子宮及胎盤按動物組織基因組（DNA）提取試劑盒說明書提取DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳［7］。③子宮及胎盤甲基綠－派諾寧染色：取固定的孕鼠子宮和胎盤于48h內(nèi)進(jìn)行石蠟包埋和切片、甲基綠－派諾寧染色（5%派諾寧、2%甲基綠）、脫水、封片并顯微鏡觀察。④ 胎盤的TUNEL檢測：取固定的子宮與胎盤于48h內(nèi)進(jìn)行石蠟包埋和切片、并按試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL顯色和鏡檢。

1.3.3 子宮及胎盤8－iso－PGF2α測定 勻漿離心后的上清液按小鼠8－iso－PGF2αElisa試劑盒的使用說明進(jìn)行洗板、孵育等操作。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品讀數(shù)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出孕鼠各個時間段的8－iso－PGF2α值。用統(tǒng)計軟件 SPSS11.5分別對孕鼠子宮和胎盤勻漿的8－iso－PGF2α進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗（Independent Samphes Test）分析。

2 結(jié)果

2.1 妊娠結(jié)局

PBS組孕鼠無明顯異常行為表現(xiàn)，而PHA組孕鼠則出現(xiàn)腹部收縮以及輕微毛發(fā)蓬松現(xiàn)象，在注射紅蕓豆PHA 7.5～9.5h后孕鼠出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象。解剖觀察表明，PBS組孕鼠子宮及胚胎均正常，而注射紅蕓豆PHA組孕鼠子宮系膜和胎盤充血明顯（圖1）；注射紅蕓豆PHA后8h及出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象時，還伴有胎鼠與胎盤脫落或易與胎盤分離、胎盤與PBS組胎盤相比明顯變薄且易與子宮分離。

圖1 小鼠胎盤充血情況直觀圖

2.2 染色結(jié)果

臺盼藍(lán)染色后肉眼觀察可見PHA組胎盤顏色較PBS組深，且子宮一側(cè)靠近邊緣處出現(xiàn)一圈深色染色區(qū)域（圖2），解剖鏡下可見此處顏色加深呈藍(lán)色。解剖鏡下亦可見PBS組與PHA組胎盤邊緣、子宮以及羊膜均有臺盼藍(lán)染色。但PHA組胎盤在近子宮一側(cè)的邊緣附近一圈染色是PBS組所沒有的。甲基綠－派諾寧染色（圖3）則顯示出：與PBS組相比，PHA組切片顏色紅色較多，綠色較少，且隨著時間推移，對比越明顯。圖3D、3F、3H較3A、3B、3C、3E、3G 顏色偏紫紅，說明注射PHA 后5h、8h及孕鼠出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象時細(xì)胞凋亡較明顯。

圖2 小鼠胎盤臺盼藍(lán)染色直觀圖（200×）

圖3 甲基綠－派諾寧染色效果圖（400×）

2.3 TUNEL檢測結(jié)果

固定后的胎盤經(jīng)DAB顯色后鏡檢可看到細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象（DAB顯色后呈棕色）。注射PHA 5h后胎盤細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象明顯高于PBS組（圖4、圖5），且在5h時細(xì)胞凋亡主要存在于胎盤近子宮側(cè)。

2.4 電泳結(jié)果

1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PBS組和PHA組胎盤DNA存在差異：PBS組電泳條帶單一，只有唯一一條條帶，而且條帶相對整齊，而PHA組條帶存在明顯的拖尾現(xiàn)象（圖6A）。子宮DNA電泳兩組無明顯差異，均出現(xiàn)單一的條帶（圖6B）。

圖4 TUNEL檢測結(jié)果圖（40×）

圖5 TUNEL染色檢測結(jié)果比較（400×）

圖6 子宮和胎盤的DNA電泳圖

2.5 8－iso－PGF2α檢測結(jié)果

注射紅蕓豆PHA后2、5、8h及流產(chǎn)時，PHA組孕鼠胎盤勻漿中8－iso－PGF2α的水平和PBS組比較無差異（表1），而孕鼠子宮勻漿中8－iso－PGF2α水平在注射紅蕓豆PHA后2h、8h及流產(chǎn)時明顯低于注射PBS組（表1）。從圖7可以看出PBS組胎盤內(nèi)和子宮內(nèi)8－iso－PGF2α水平的變化趨勢是一致的，但PHA組胎盤內(nèi)和子宮內(nèi)8－iso－PGF2α水平的變化趨勢并不一致，子宮內(nèi)8－iso－PGF2α在注射PHA后到孕鼠出現(xiàn)流產(chǎn)時呈下降趨勢。

表1 胎盤和子宮8－iso－PGF2α含量隨時間變化情況（pg／ml）

圖7 胎盤和子宮中8－iso－PGF2α水平濃度變化情況折線圖

3 討論

胎盤承擔(dān)著母體與胎兒間營養(yǎng)物質(zhì)與代謝物質(zhì)交換的重任，同時胎盤還分泌許多與妊娠相關(guān)的激素，所以，胎盤功能的保持對維持妊娠是至關(guān)重要的。本實驗結(jié)果表明，在注射紅蕓豆PHA后孕鼠胎盤表觀出現(xiàn)淤血現(xiàn)象，胎盤部分的臺盼藍(lán)著色也表明PHA處理組導(dǎo)致胎盤組織出現(xiàn)細(xì)胞死亡。與甲基綠—派諾寧染色以及TUNEL檢測、電泳結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)比較均說明小鼠胎盤在注射紅蕓豆PHA后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡和組織壞死。進(jìn)而，紅蕓豆PHA產(chǎn)生的凝血作用也應(yīng)該是造成胎盤喪失維持妊娠作用的一個重要原因。妊娠中期胎盤產(chǎn)生大量的孕酮［8］，胎盤受損必然導(dǎo)致其功能受影響，例如直接影響胎盤孕酮的合成和損害胎盤血液循環(huán)。這些都是導(dǎo)致妊娠終止的原因。

本實驗中注射PHA后子宮勻漿8－iso－PGF2α水平明顯下降，與引產(chǎn)［9］和自然分娩［10］的子宮中，PGF2α顯著升高的結(jié)論不太一致，其原因可能有兩點(diǎn)。其一，文獻(xiàn)［9－10］中測定的是子宮腔內(nèi)液的PGF2α水平，而本實驗檢測的是子宮組織勻漿中的PGF2α水平。在分離子宮和胎盤后，均用紗布擦干表面液體，然后再勻漿處理，因此子宮勻漿PGF2α水平偏低很可能是因為原先合成的PGF2α已大量釋放。其二，PGF2α的作用程序與子宮狀態(tài)和激素水平有關(guān)。子宮肌細(xì)胞上PG受體隨妊娠進(jìn)展而增加，分娩期達(dá)高峰，中晚期妊娠子宮對PG更為敏感［11－12］。PHA 組子宮勻漿 8－iso－PGF2α水平明顯下降可能與胎盤的變化有關(guān)聯(lián)，雖然檢測結(jié)果中注射PHA后胎盤勻漿8－iso－PGF2α水平升高無統(tǒng)計學(xué)意義，但是PHA組每個受測個體8－iso－PGF2α水平均高于PBS組。

與天花粉蛋白［13］一樣，紅蕓豆PHA在終止妊娠時，對作用部位有一定的細(xì)胞專一性。綜合以上及相關(guān)實驗結(jié)果，我們認(rèn)為紅蕓豆PHA終止妊娠的機(jī)制在對胎盤的專一性結(jié)合和作用方面與天花粉蛋白是類似的，即紅蕓豆PHA與胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞結(jié)合后，通過損傷引起細(xì)胞凋亡和副凋亡途徑，從而破壞滋養(yǎng)層細(xì)胞（特別是合體滋養(yǎng)層細(xì)胞）。通過產(chǎn)生壞死和凝血等綜合作用，進(jìn)而達(dá)到終止妊娠的作用。但也有所區(qū)別，比如其顯著的凝血作用。而且紅蕓豆PHA幾乎沒有任何天花粉表現(xiàn)出的毒副作用［14－15］。

通過廣泛深入的研究和驗證，紅蕓豆PHA有可能發(fā)展成為一種高效，具有特異性和作用范圍更廣的新型終止妊娠藥物。

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