高海寧　王艷杰　趙丹玉　崔　勇　柳　春(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧　沈陽(yáng)　0032)

六味地黃丸抑制H2O2誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

高海寧1王艷杰趙丹玉崔勇柳春
(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110032)

〔摘要〕目的探討經(jīng)典名方六味地黃丸對(duì)H2O2所致PC12細(xì)胞凋亡時(shí)bax、caspase-8和bcl-2基因和蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。方法把大鼠腎上腺嗜鉻瘤(PC-12)細(xì)胞分為4組:對(duì)照組、模型組、六味地黃丸組、維生素(Vit) E組。待細(xì)胞培養(yǎng)24 h貼壁后吸去培養(yǎng)液，對(duì)照組和模型組都加入含10％大鼠血清培養(yǎng)液，六味地黃丸組和VitE組分別加入含10％六味地黃丸大鼠血清培養(yǎng)液和含VitE的培養(yǎng)液，預(yù)保護(hù)24 h后，除對(duì)照組之外的各組加入H2O2終濃度為200 μmol/L，對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24 h后離心收集細(xì)胞，提取總RNA和蛋白。應(yīng)用RT-PCR和Western印跡方法分別測(cè)定bax、caspase-8、bcl-2基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。結(jié)果六味地黃丸能下調(diào)bax、caspase-3基因和蛋白的表達(dá)，對(duì)bcl-2基因和蛋白表達(dá)有上調(diào)作用。結(jié)論六味地黃丸能通過(guò)有效降低bax、caspase-8基因和蛋白表達(dá)，提高bcl-2的表達(dá)，抑制、阻止PC-12細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。

〔關(guān)鍵詞〕六味地黃丸; PC-12;細(xì)胞凋亡

1沈陽(yáng)體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院

第一作者:高海寧(1979-)，女，副教授，在讀博士，主要從事運(yùn)動(dòng)生理學(xué)研究。

神經(jīng)元變性丟失、大量老年斑(SP)及神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)形成是阿爾茨海默病(AD) AD的主要病理改變，同時(shí)伴有彌漫性大腦皮層萎縮〔1，2〕。細(xì)胞凋亡在AD患者神經(jīng)元的丟失中扮演重要角色，與AD的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切〔1，2〕。神經(jīng)細(xì)胞損傷是不可復(fù)原的，越來(lái)越多的證據(jù)認(rèn)為，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和壞死的重要原因〔3，4〕。H2O2是活性氧簇(ROS)的一種重要形式，作為機(jī)體正常有氧代謝的產(chǎn)物，在濃度過(guò)高時(shí)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，引起組織和細(xì)胞的損傷。H2O2通過(guò)幾種不同的分子機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究通過(guò)H2O2誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞凋亡，從分子學(xué)水平探討六味地黃丸對(duì)改善AD發(fā)生的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料大鼠腎上腺嗜鉻瘤(PC12)細(xì)胞，高分化，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所生化與細(xì)胞所; H2O2(35％ W/W水溶液)，購(gòu)于阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司; DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗、胰酶，購(gòu)于Hyclone公司; TaKaRa RNA PCR試劑盒(AMV) Ver.3.0及bax、caspase-3、bcl-2引物購(gòu)于TaKaRa大連寶生物公司; BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技研究所; DAB顯色試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。1.2實(shí)驗(yàn)儀器水套二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Forma SeriesⅡ，美國(guó)) ;生物安全柜(HFsafe-1200，上海力申科技有限公司) ;酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD iMark) ;凝膠成像分析儀(WD-9413B，北京市六一儀器廠) ;梯度PCR儀(MycyclerTM Thermal Cycle，美國(guó)BIO-RAD) ;高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(TGL-20M，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.3六味地黃丸含藥血清制備大鼠按體重隨機(jī)分為對(duì)照組和六味地黃丸組，生藥質(zhì)量濃度為0.75 kg/L，水溶液按10 ml/kg六味地黃丸水溶液灌胃，每天2次，空白組給予同體積雙蒸水灌胃，連續(xù)給藥7 d，第7天首次給藥1.5 h后腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h，2 000 r/min離心10 min后分離血清。經(jīng)56℃，30 min滅活，0.22 μm濾膜過(guò)濾滅菌，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4細(xì)胞的培養(yǎng)PC12細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的情況，2～3 d按照1∶3的比例傳代一次，采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5實(shí)驗(yàn)分組及步驟含藥血清濃度10％為最佳濃度，含藥血清作用預(yù)保護(hù)24 h。因此，將細(xì)胞按5×105/ml密度接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶加培養(yǎng)基3 ml，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞計(jì)數(shù)分四組，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育24 h貼壁后，對(duì)照組的培養(yǎng)基換為含有10％濃度蒸餾水灌胃雄性大鼠血清預(yù)保護(hù)24 h;模型組培養(yǎng)基同樣換成含有10％濃度蒸餾水灌胃雄性大鼠血清預(yù)保護(hù)24 h后加入H2O2終濃度為200 μmol/L;六味地黃丸組培養(yǎng)基換為含有10％濃度六味地黃丸灌胃雄性大鼠血清預(yù)保護(hù)24 h后加入H2O2終濃度為200 μmol/L; VitE組培養(yǎng)基換為含有20 μmol/L VitE和10％濃度蒸餾水灌胃雄性大鼠血清預(yù)保護(hù)24 h后加入H2O2終濃度為200 μmol/L。24 h后提取各組總RNA和蛋白，深溫冰箱保存待檢。

1.6RT-PCR檢測(cè)Bax mRNA、caspase-8 mRNA和bcl-2 mRNA各組細(xì)胞加藥處理結(jié)束后，提取細(xì)胞總RNA，分別測(cè)定并計(jì)算A260 nm/280 nm值及其比值，以鑒定純度。隨后用RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。引物由TaKaRa大連寶生物公司合成。β-actin引物序列:上游引物: 5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3';下游引物: 5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'，PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度為592 bp。bcl-2引物序列:上游: 5'-GCTACGAGTGGGATACTGGAGA-3';下游: 5'-AGTCATCCACAGAGC GATGTT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA全長(zhǎng)為446 bp。bax引物序列:上游: 5'-CATCTCCTTCATCCTTGCTG-3';下游: 5'-CCAGCC ACAAAGATGGTCACT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA全長(zhǎng)為337 bp。caspase-8引物序列:上游: 5'-CCCGTGAAGCAAGGATTT-3';下游: 5'-ACTGTGGGTCTGGGAAGC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA全長(zhǎng)為488 bp。反應(yīng)參數(shù):熱啟動(dòng)94℃預(yù)變性2 min; 94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)。72℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳，WD-9413B凝膠成像分析儀進(jìn)行拍照、圖像分析。

1.7Western印跡檢測(cè)Bax、caspase-8和bcl-2的蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解，12 000 r/min，4℃離心10 min，用BCA試劑進(jìn)行蛋白定量。以四組中提取蛋白濃度最小組為基礎(chǔ)，其余三組蛋白稀釋?zhuān)顾慕M蛋白濃度一致后，取各組蛋白樣品各100 μl，加入5×上樣緩沖液25 μl，100℃煮5 min，冷卻后，每泳道上樣量30 μl，10％SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用含5％脫脂牛奶的TBST 37℃下封閉2 h，1∶1 000加入Bax、caspase-8、bcl-2及β-actin的一抗于4℃過(guò)夜，TBST快洗膜3次，慢洗3次，每次5 min，加入相應(yīng)的二抗37℃孵育2 h后，TBST快洗膜3次，慢洗3次，每次5 min，使用DAB顯色劑顯色，結(jié)果用圖像分析儀分析，以面積和光密度的乘積為積分光密度表示。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行one-way ANOVA分析。

2　結(jié)果

與對(duì)照組相比，模型組H2O2作用24 h后，bax和caspase-8 mRNA和蛋白平均光密度值顯著升高，即其含量顯著升高(P＜0.01)，而六味地黃丸組和VitE組預(yù)保護(hù)24 h之后，與模型組相比bax和caspase-8 mRNA和蛋白平均光密度值均有顯著降低(P＜0.01，P＜0.05)。與對(duì)照組相比，模型組H2O2作用24 h后，bcl-2 mRNA和蛋白平均光密度值顯著降低，即其含量顯著降低(P＜0.01)，而六味地黃丸組和VitE組預(yù)保護(hù)24 h之后，與模型組相比bcl-2 mRNA和蛋白平均光密度值均有顯著升高(P＜0.01)。見(jiàn)表1、表2和圖1、圖2。

表1　各組PC-12細(xì)胞中bax、caspase-8及bcl-2 mRNA及β-actin mRNA表達(dá)(±s，n=6)

表1　各組PC-12細(xì)胞中bax、caspase-8及bcl-2 mRNA及β-actin mRNA表達(dá)(±s，n=6)

與對(duì)照組比較: 1) P＜0.01;與模型組比較: 2) P＜0.05，3) P＜0.01

組別　bax/β-actin　 caspase-8/β-actin　 bcl-2/β-actin對(duì)照組　0.262±0.048　 0.293±0.061　 0.427±0.035模型組　0.448±0.0321)　0.478±0.0411)　0.254±0.0741)六味地黃丸組　0.351±0.0343)　0.367±0.0543)　0.333±0.0822)VitE組　0.346±0.0123)　0.394±0.0822)　0.309±0.0452)

圖1　各組PC-12細(xì)胞中bax mRNA、caspase-8 mRNA、bcl-2 mRNA及β-actin mRNA表達(dá)

表2　各組PC-12細(xì)胞中bax、caspase-8、bcl-2及β-actin蛋白表達(dá)(±s，n=4)

表2　各組PC-12細(xì)胞中bax、caspase-8、bcl-2及β-actin蛋白表達(dá)(±s，n=4)

與對(duì)照組比較: 1) P＜0.01;與模型組比較: 2) P＜0.05，3) P＜0.01

組別　bax/β-actin　 caspase-8/β-actin　 bcl-2/β-actin對(duì)照組　0.242 7±0.003 5 0.161 8±0.020 7 0.108 4±0.009 6模型組　0.124 8±0.012 71)0.085 1±0.009 11)0.165 9±0.014 71)六味地黃丸組0.201 4±0.015 93)0.147 1±0.024 13)0.120 8±0.020 13)VitE組　0.198 9±0.020 73)0.148 3±0.016 03)0.134 4±0.008 62)

圖2　各組PC-12細(xì)胞中bax、caspase-8、bcl-2及β-actin蛋白的表達(dá)

3　討論

六味地黃丸的記載始見(jiàn)于宋代名醫(yī)、兒科專(zhuān)家錢(qián)乙的《小兒藥證直訣》，用來(lái)治療小兒先天不足、發(fā)育遲緩等病癥，是滋陰補(bǔ)腎的傳統(tǒng)基礎(chǔ)方劑。組成:熟地黃24 g，山萸肉、淮山藥各12 g，澤瀉、茯苓、丹皮各9 g。Bax和bcl-2都屬于bcl基因家族，Bax能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而促進(jìn)細(xì)胞死亡，bcl-2阻斷細(xì)胞凋亡而促進(jìn)細(xì)胞存活。Bax與bcl-2功能相反，bcl-2和Bax的表達(dá)強(qiáng)度決定細(xì)胞命運(yùn)〔5〕。神經(jīng)細(xì)胞是一種已停止分化并長(zhǎng)期存活的細(xì)胞，其損傷是不可復(fù)原的。PC-12細(xì)胞在H2O2誘導(dǎo)下，細(xì)胞內(nèi)Bax占優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展。本文說(shuō)明六味地黃丸和VitE通過(guò)阻止bax的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而促進(jìn)細(xì)胞死亡，并促進(jìn)bcl-2的表達(dá)來(lái)阻斷細(xì)胞凋亡而促進(jìn)細(xì)胞存活，從而減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

另外大量研究顯示，細(xì)胞凋亡過(guò)程與caspase底物的切割密切相關(guān)〔6〕。caspase家族中有6種被認(rèn)為肯定參與了細(xì)胞凋亡的過(guò)程，即caspase-3、-6、-7、-8、-9和-10。通常caspase-8介導(dǎo)死亡受體通路的細(xì)胞凋亡。有報(bào)道caspase-8能切割bcl家族成員從而激活一系列連鎖反應(yīng)，最終促進(jìn)caspase-3活化，發(fā)揮促凋亡作用。本文說(shuō)明PC-12細(xì)胞內(nèi)caspase-8含量降低，從而減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

AD的病因在于腎中精氣不足，現(xiàn)代研究表明六味地黃丸主治“腎怯，神不足”，具有抗衰老及抗氧化作用，對(duì)于老年癡呆、神經(jīng)衰弱及健忘均有良好療效。六味地黃丸改善AD發(fā)生是通過(guò)有效降低Bax、caspase-8基因和蛋白表達(dá)，提高bcl-2的表達(dá)，從而抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡和壞死，起到延緩衰老的作用。

4　參考文獻(xiàn)

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5王彤，劉存志，劉玉珍，等.Bcl-2/bax基因調(diào)控機(jī)體細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕．中國(guó)老年學(xué)雜志，2008; 28(16) : 1658-60.

6 Zhu YS，Chen Q.Mitochondria and apoptosis regulation〔J〕．Chin Bull Life Sci，2008; 4(20) : 506-13.

〔2014-03-21修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者:柳春(1963-)，女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥對(duì)臟腑功能調(diào)控作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究。

基金項(xiàng)目:遼寧省科學(xué)技術(shù)規(guī)劃項(xiàng)目(No．2012225018) ;沈陽(yáng)體育學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(XKFX1511)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R365

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015) 16-4437-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.008