蘇嬌嬌，馮 慧，姚瑋艷，陳 熹，張辰宇，王亞雷

胰腺癌細(xì)胞與其基質(zhì)成纖維細(xì)胞相互影響的研究

蘇嬌嬌1，馮 慧1，姚瑋艷2，陳 熹3，張辰宇3，王亞雷1

摘要目的 觀察胰腺癌細(xì)胞系BXPC-3、SW1990能否促進(jìn)其基質(zhì)中正常成纖維細(xì)胞（NFs）活化成癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）及其活化的可能機(jī)制，以及活化后的CAFs對BXPC-3、SW1990細(xì)胞遷移能力的影響。方法 采用差異貼壁法分選出野生型小鼠C57胰腺組織中的NFs，后運(yùn)用非接觸式共培養(yǎng)方法將BXPC-3、SW1990與NFs共培養(yǎng)，共培養(yǎng)后采用免疫熒光方法檢測共培養(yǎng)前后NFs中CAFs標(biāo)志性蛋白α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）的表達(dá)變化，以確定其是否活化，并且運(yùn)用qRT-PCR法檢測目前較公認(rèn)的胰腺癌中升高的12種miRNAs在共培養(yǎng)前后的NFs中含量變化；采用transwell法觀察活化前后的NFs對BXPC-3、SW1990遷移能力的影響。結(jié)果 免疫熒光檢測表明，與BXPC-3、SW1990共培養(yǎng)后，NFs中α-SMA、FAP表達(dá)均顯著升高；同時(shí)，在所選取的12種miRNAs中，與BXPC-3、SW1990共培養(yǎng)后，NFs中miR-155含量均有明顯升高。BXPC-3、SW1990在CAFs基質(zhì)環(huán)境中遷移能力大大提高。結(jié)論 胰腺癌細(xì)胞能夠促進(jìn)其周圍NFs活化成CAFs，其活化可能與胰腺癌中某些特定的miRNA分泌進(jìn)入到NFs中有關(guān)，活化后的CAFs又可以反過來促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移。

關(guān)鍵詞胰腺癌；癌相關(guān)成纖維細(xì)胞；miRNAs；遷移

2015－01－02接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，合肥 2300222上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科，上海200025

3江蘇省小核糖核酸工程研究中心，南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210000

近年來研究［1－2］顯示腫瘤的發(fā)生發(fā)展與由多種基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子等組成的腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，其中基質(zhì)細(xì)胞中的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）越來越受到關(guān)注。胰腺癌作為臨床上惡性程度極高的腫瘤，總體5年生存率低于5%，其病因和發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，針對胰腺癌細(xì)胞本身的治療也療效欠佳［3－4］。目前對胰腺癌中CAFs的產(chǎn)生機(jī)制以及CAFs對胰腺癌細(xì)胞的影響尚不完全清楚，該研究擬通過胰腺癌細(xì)胞系與正常成纖維細(xì)胞（normal fibroblasts，NFs）共培養(yǎng)構(gòu)建CAFs模型初步研究其產(chǎn)生機(jī)制以及其對胰腺癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞與試劑 野生型C57小鼠由南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物房提供；人胰腺癌細(xì)胞系BXPC-3、SW1990購自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；膠原酶購自美國Sigma公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）一抗、成纖維細(xì)胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）一抗、熒光二抗和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚［2-（4-Amidinophenyl）-6-indolecarbamidine dihydrochloride，DAPI］均購自英國Abcam公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；TaqMan microRNA探針、AMV酶等試劑均購自美國TaKaRa公司；共培養(yǎng)小室購自德國Merckmillipore公司。

1．2 原代細(xì)胞培養(yǎng) 提取10周大小正常野生型C57小鼠胰腺組織，用D-Hank液沖洗新鮮胰腺組織，并將組織剪成2～3 cm2碎塊后置于膠原酶中，37℃消化20 min，然后加入等體積含10%DMEM培養(yǎng)基終止消化。1 000 r／min離心5 min，棄上清液，重懸后置于15%FBS DMEM＋1%雙抗培養(yǎng)基、37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。采用差異貼壁法分選出NFs，將分選出的NFs的第2～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1．3 細(xì)胞共培養(yǎng) 胰腺癌細(xì)胞系與NFs用胰酶消化，1 000 r／min離心5 min，用3 ml DMEM培養(yǎng)基重懸。選取1 ml重懸液，再將其稀釋20倍，將稀釋后的細(xì)胞混懸液充分混勻，選取10 μl重懸液放于細(xì)胞計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù)。最后將BXPC-3、SW1990與NFs分別按3∶1的細(xì)胞數(shù)比例鋪于0.4 μm孔徑的共培養(yǎng)小室中。上室放BXPC-3或SW1990細(xì)胞（各自約1.2×105個），下室放NF細(xì)胞（約0.4×105個），將共培養(yǎng)小室置于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中；共培養(yǎng)時(shí)，上

室用含10%血清DMEM培養(yǎng)基，下室用含15%血清DMEM培養(yǎng)基；在上述環(huán)境中將細(xì)胞共培養(yǎng)4～5 d，每1～2 d換液1次，每次換液時(shí)上下室同時(shí)更換培養(yǎng)基；所用培養(yǎng)基同前，共培養(yǎng)結(jié)束后，撤去上室，用倒置顯微鏡觀察下室的NFs，拍照觀察比較共培養(yǎng)前后的NFs形態(tài)變化，并將細(xì)胞用于以后實(shí)驗(yàn)。

1．4 免疫熒光方法檢測蛋白含量 用4%多聚甲醛固定NFs 20 min，PBS洗滌后，用0．5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）通透細(xì)胞膜30 min；室溫封閉1 h后，分別孵育α-SMA一抗，F(xiàn)AP一抗4℃過夜，在避光條件下孵育熒光二抗1 h；PBS洗滌后用DAPI染核5 min。細(xì)胞處理結(jié)束后在熒光顯微鏡下拍攝被α-SMA、FAP標(biāo)記的細(xì)胞視野，然后變換熒光通道；拍攝相同視野下被DAPI染出的細(xì)胞核形態(tài)，最后運(yùn)用olympusmicro軟件將拍出的兩張圖片合并（即將上述兩張圖進(jìn)行Merge處理）；最終計(jì)算顯微鏡視野中所見的被α-SMA或FAP蛋白標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例（顯微鏡下選取最具代表性的5個視野作為統(tǒng)計(jì)依據(jù)），以此初步評估NFs是否被活化成CAFs。

1．5 qRT-PCR法檢測共培養(yǎng)前后NFs中特定miRNA含量變化 根據(jù)文獻(xiàn)［12］，選取miR-20a、miR-21、miR-24、miR-25、miR-31、miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-181b、miR-196a、miR-221、miR-375等12種miRNAs，檢測培養(yǎng)前后NFs中上述miRNA含量變化。用TRIzol Reagent試劑提取NFs中的RNA，用1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；逆轉(zhuǎn)錄在200 μl離心管中進(jìn)行，為10 μl體系，反應(yīng)條件為16℃30 min，42℃30min，85℃5 min。運(yùn)用TaqMan PCR試劑盒在PCR反應(yīng)條件下通過ABI Prism 7300 SDS系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，所用的miRNA探針由美國TaKaRa公司合成。具體條件為95℃5 min，95 ℃15 s連續(xù)40個循環(huán)反應(yīng)，60℃1 min；利用ABI Prism 7300 SDS軟件V1．3．1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并運(yùn)用U6作為內(nèi)參，ΔΔCt＝（Ct miRNA-Ct U6）（共培養(yǎng)后）－（Ct miRNA-Ct U6）（共培養(yǎng)前）。

1．6 細(xì)胞遷移功能實(shí)驗(yàn) 將胰腺癌細(xì)胞系BXPC-3 或SW1990（各自約3×104個／小室）放于8 μm孔徑的經(jīng)過fibronectin包被的transwell小室的上室中，下室為活化的CAFs，以NFs作為陰性對照。上下室細(xì)胞均在含10%血清的DMEM培養(yǎng)基孵育約12 h，取出上室；用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，用0．1%結(jié)晶紫染色15 min，在水中輕柔的用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，后將小室倒置，風(fēng)干，分別計(jì)數(shù)附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室里的細(xì)胞，以此判斷癌細(xì)胞在不同基質(zhì)環(huán)境中的遷移能力。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行分析，組間差異的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2．1 NFs形態(tài)觀察 采用差異貼壁法分選出小鼠胰腺組織中的NFs，可見NFs外觀呈梭形，胞體大，達(dá)一定密度時(shí)在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底部形成漩渦狀改變。見圖1A。

2．2 CAFs檢測

2．2．1 CAFs形態(tài)觀察 將胰腺癌細(xì)胞與NFs共培養(yǎng)4～5 d后，在倒置顯微鏡下觀察CAFs形態(tài)亦呈梭形，外觀與NFs無明顯區(qū)別。見圖1B。

2．2．2 共培養(yǎng)后α-SMA、FAP蛋白表達(dá)水平變化免疫熒光方法檢測顯示，與陰性對照相比，NFs與BXPC-3細(xì)胞共培養(yǎng)之后，其α-SMA表達(dá)量上升了（3.08±0.48）倍（F＝12.61，P＜0.05），F(xiàn)AP蛋白表達(dá)量上升了（2.74±0.420）倍（F＝9.86，P＜0.05）；與SW1990細(xì)胞共培養(yǎng)后，NFs中α-SMA表達(dá)量上升了（2.05±0.47）倍（F＝10.89，P＜0.05），F(xiàn)AP蛋白表達(dá)量上升了（2.46±0.08）倍（F＝8.89，P＜0.05）。提示共培養(yǎng)之后的NFs被活化成CAFs。見圖2。

2．2．3 共培養(yǎng)前后NFs中某些特定miRNA含量變化 qRT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌普遍認(rèn)為升高的12種miRNAs中，NFs與BXPC-3細(xì)胞共培養(yǎng)后其中miR-155含量升高了（1.50±0.45）倍（F＝9.85，P＜0.05），與SW1990細(xì)胞共培養(yǎng)之后其中miR-155含量升高了（1.95±0.65）倍（F＝8.26，P ＜0.05）。提示在胰腺癌周圍NFs活化過程中，miR-155可能從胰腺癌細(xì)胞中分泌到其周圍NFs中，并發(fā)揮了促進(jìn)活化的作用。見圖3。

2．3 CAFs對胰腺癌細(xì)胞遷移能力的影響 transwell實(shí)驗(yàn)表明，與陰性對照相比，BXPC-3、SW1990細(xì)胞在CAFs基質(zhì)中遷移能力分別上升了（80.28± 0.27）%、（75.28±0.22）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F ＝5.87、4.66，P＜0.01）。見圖4。

3 討論

近年來研究［5］顯示，腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境類似于“種子”與“土壤”的關(guān)系，即腫瘤微環(huán)境可以為腫瘤細(xì)胞提供良好的“土壤”，促進(jìn)“種子”（腫瘤細(xì)胞）的生長。腫瘤微環(huán)境中含有CAFs、內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞，可以分泌各種細(xì)胞因子、趨化因子等，從而影響癌細(xì)胞的遷移、血管生成、增殖、免疫認(rèn)知等功能，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移［6］。

在胰腺癌中，基質(zhì)細(xì)胞占了腫瘤體積的90%，CAFs占據(jù)了大部分的基質(zhì)成分［2］。但是，目前對于胰腺癌與癌旁基質(zhì)之間相互影響的內(nèi)在機(jī)制尚不清楚，且當(dāng)前主要的研究［7］均集中于已活化的CAFs

引起胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。對于胰腺癌中CAFs從何而來，通過何種途徑轉(zhuǎn)化而來，目前知之甚少。這也限制了通過干擾胰腺癌-癌旁基質(zhì)的相互作用進(jìn)而抑制胰腺癌發(fā)展的研究。

CAFs是實(shí)質(zhì)腫瘤間質(zhì)中數(shù)量最豐富的細(xì)胞類型，可以釋放表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β及趨化因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出各種惡性生物學(xué)行為［8］。該研究將提取的NFs與胰腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)之后的NFs中α-SMA、FAP蛋白含量顯著升高。有研究［6，9］顯示α-SMA、FAP蛋白在控制成纖維細(xì)胞生長及胚胎發(fā)育組織修復(fù)和上皮性腫瘤的演進(jìn)過程中可能起一定的作用，且在CAFs中含量明顯升高，是比較公認(rèn)的CAFs標(biāo)志性蛋白，結(jié)合該研究結(jié)果顯示，在共培養(yǎng)之后，NFs被活化為CAFs。目前認(rèn)為CAFs的來源主要有：①NFs被激活后演變而來；②骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)歷某些刺激后轉(zhuǎn)化而來；③腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷上皮至間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中產(chǎn)生。其中NFs被激活被認(rèn)為是其主要來源［6，10］，該研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。

miRNA是一種非蛋白質(zhì)編碼的RNA，它通過與靶mRNA的3′-UTR結(jié)合，降解或者抑制mRNA的翻譯導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄后靜默，從而參與靶基因功能的調(diào)節(jié)。目前研究［11］顯示miRNA不僅僅存在于細(xì)胞中，還可能通過某種特定方式分泌到體液循環(huán)中，并且進(jìn)入另一種細(xì)胞中發(fā)揮作用。該研究對共培養(yǎng)前后NFs中miRNA的含量變化進(jìn)行了初步的研究。該研究根據(jù)既往文獻(xiàn)［12］的報(bào)道，選取了在胰腺癌組織中升高明顯的miR-155、miR-221、miR-375等12 種miRNAs，檢測在共培養(yǎng)前后NFs中這些miRNAs含量的變化，結(jié)果顯示miR-155含量在共培養(yǎng)之后明顯升高，提示miR-155可能通過某種特殊方式從胰腺癌細(xì)胞進(jìn)入基質(zhì)成纖維細(xì)胞，并且在其中發(fā)揮一定作用促進(jìn)NFs活化。

該研究將胰腺癌細(xì)胞系在不同基質(zhì)環(huán)境（即NFs、CAFs）中進(jìn)行transwell實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在CAFs基質(zhì)環(huán)境中胰腺癌細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)。這與目前大部分的腫瘤研究［7］結(jié)果類似，進(jìn)一步證實(shí)了CAFs在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。有研究［13］顯示在卵巢癌中被激活的CAFs可以通過分泌肝細(xì)胞生長因子等細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。在胰腺CAFs對癌細(xì)胞的影響過程中有哪些因素參與其中，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，該研究反映了胰腺癌細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間存在交互作用，互相影響，互相促進(jìn)，從而導(dǎo)致了胰腺癌細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展。

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The interaction between pancreatic cancer cells and fibroblasts

Su Jiaojiao1，F(xiàn)eng Hui1，Yao Weiyan2，et al
（1Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Gastroenterology，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200025）

AbstractObjective To investigate whether the pancreatic cancer cells BXPC-3，SW1990 can activate normal fibroblasts（NFs）into cancer-associated fibroblasts（CAFs）and the possible mechanism and whether CAFs can motivate the migration of the cancer cells．Methods NFs were isolated from mouse pancreas tissues of wild C57，then NFs were cultured with BXPC-3 or SW1990 cells by indirect co-cultures，and detected the content of the specific proteins α-SMA，F(xiàn)AP in fibroblasts by immunofluorescence assay，then detected the content of the 12 different kinds of miRNAs in fibroblasts which were regarded as overexpressed in pancreatic cancer by qRT-PCR，and estimated the effect of the different fibroblasts（NFs，CAFs）on cancer cell migration by transwell．Results After cocultered with BXPC-3 or SW1990 cells，the α-SMA and FAP level in fibroblasts increased dramatically．Among the selected 12 kinds of miRNAs，after cocultered with BXPC-3 or SW1990 cells，the content of miR-155 in fibroblasts raised significantly．The migration of BXPC-3，SW1990 cells increased dramatically in the environment of CAFs compared with the environment of NFs．Conclusion BXPC-3 or SW1990 cells can activate NFs into CAFs，and miRNAs may play an important role in the process，then CAFs can reversely motivate the migration of BXPC-3 or SW1990 cells．

Key wordspancreatic cancer；cancer-associated fibroblasts；miRNAs；transwell

作者簡介：蘇嬌嬌，女，碩士研究生；王亞雷，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：alei416＠163．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：81101849／H1617）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0427－05

中圖分類號R 735．9