劉 祥，張金穎，張永萍，仲英娜

IL-28B基因多態(tài)性與新疆維吾爾族HCV易感性研究

劉 祥1，2，張金穎2，張永萍2，仲英娜1，2

摘要目的 探討白介素-28B（IL-28B）基因的多態(tài)性與新疆維吾爾族慢性丙型肝炎感染易感性的關聯(lián)。方法 選取180例新疆維吾爾族慢性丙肝患者作為HCV組，150例維族健康體檢者作為健康對照組，通過PCR產(chǎn)物測序法檢測兩組受試者IL-28B rs8099917、rs12979860基因型和等位基因分布頻率，對兩組基因型和等位基因差異進行分析；同時在HCV組中，對不同IL-28B基因型人群的HCV-RNA載量、肝功能、血脂等進行分析。結果 ①rs8099917在HCV組和健康對照組中TT和TG／GG基因型頻率差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝11.627，P＝0.001，OR＝1.363，95%CI：1.107～1.591）；G等位基因率在兩組間差異明顯，HCV組中占10.6%，健康對照組0.17%（χ2＝7.011，P＝0.008，OR＝0.658，95%CI：0.512～0.905）；②rs12979860在兩組間的基因型和等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義；③rs12979860 TT型患者的HCVRNA高于TG／GG型，差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.032）；患者肝功血脂差異與IL-28B基因多態(tài)性中無關。結論 新疆維吾爾族人群中HCV的易感性與IL-28B rs8099917基因多態(tài)性有關聯(lián)，rs8099917中等位基因G是新疆維族HCV患者的易感基因。

關鍵詞白介素-28B；丙型病毒性肝炎；基因多態(tài)性；易感性

2015－01－05接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學新疆臨床學院，烏魯木齊 830001

2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院感染科，烏魯木齊 830001

1989年人類發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）為一種新的肝炎病毒，發(fā)明了HCV抗體檢測技術并用于篩選供血者，從而使通過靜脈輸血感染丙肝的人數(shù)明顯下降。但是，2011年全球仍有約1.3～1.7億HCV慢性感染者［1］，是導致肝硬化和肝癌的主要病因。2009年，研究［2］報道了HCV感染者的白介素-28B（interleukin-28B，IL-28B）（rs12979860、rs8099917）基因多態(tài)性與長效干擾素聯(lián)合利巴韋林治療的應答反應以及HCV感染后的自發(fā)清除率有明顯的關聯(lián)性［3］。IL-28B基因的多態(tài)性與HCV感染后的結局密切相關，其中，位于IL-28B基因rs8099917、rs12979860單核苷酸多態(tài)性與HCV的易感性最強［2－3］。國內(nèi)文獻［4］報道了漢族人群IL28B基因多態(tài)性與HCV易感性密切相關，但是新疆維族人群HCV易感性是否與IL-28B基因多態(tài)性有關尚未見報道，該研究選取新疆維族HCV感染者和維族健康對照組，檢測IL-28B基因rs8099917、rs12979860兩位點的基因型以及等位基因頻率，并分析不同IL-28B基因型對HCV感染后HCV-RNA、肝功能水平、血脂的影響，探討新疆維吾爾族HCV感染的影響因素。

1 材料與方法

1．1 病例資料 選擇2010年～2013年新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院肝病中心就診的新疆維族HCV患者180例作為HCV組，均符合《丙型肝炎防治指南》診治標準［5］。所有患者確診為慢性丙型病毒性肝炎，且抗HCV抗體與HCV-RNA均為陽性。選擇年齡、性別、體重指數(shù)等差異無統(tǒng)計學意義的維吾爾族健康體檢者150例作為健康對照組。排除標準：兩組人群均排除妊娠及哺乳期的婦女，存在肝炎后肝硬化失代償性的患者，合并乙型肝炎病毒、丁性肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒感染的患者或其他感染性疾病的患者，及合并自身免疫性疾病、嚴重精神性疾?。ㄈ缫钟舭Y）、惡性腫瘤、甲狀腺疾病患者，有吸毒或酗酒史的患者等。所有受試者來自新疆維吾爾自治區(qū)，無民族間遺傳干擾（家族成員與其他民族人無通婚情況）、連續(xù)兩代及以上長期居住于新疆的維吾爾族人群，均簽署書面的知情同意書。本研究由新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準，符合倫理審查標準，符合赫爾辛基宣言。

1．2 主要試劑和儀器 采用病例對照研究，采集受試者外周靜脈血（抗凝），使用基因組DNA提取試劑盒（北京東林昌盛生物科技有限公司）提取DNA。PCR擴增各個基因位點，設計引物rs8099917（F：5′-ACTTGTTCCTTGTAAAAGATTCCA-3′，R：5′-AACC CCACCTCAAATTATCCT-3′）、rs12979860（F：5′-ATTCCTGGACGTGGATGGGTAC-3′，R：5′-AGCGCGGAGTGCAATTCA-3′）。50 μl PCR反應體系：2xTaq

PCR mix 25 μl，10 μmol／L上下游引物各1 μl，模板1 μl，超純水補足至50 μl。所用試劑購自北京鼎國生物工程公司。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s以及72℃延伸20 s 共35個循環(huán)；然后72℃延伸10 min，最后4℃保存。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，判定PCR產(chǎn)物擴增出目的條帶的質(zhì)量。測序PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由北京東林昌盛生物科技有限公司進行正向向測序。HCV-RNA采用全自動熒光定量PCR儀以及其配套試劑進行檢測，肝功能及血脂等生化指標由新疆自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢驗中心進行檢測。

1．3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13．0軟件進行分析，定量資料以±s表達；中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，定量資料比較采用兩獨立樣本的t檢驗；定性資料采用數(shù)量（%）表示，對IL-28B基因型和等位基因頻率進行統(tǒng)計分析，各組間基因型和等位基因頻率的比較采用χ2檢驗，對等位基因頻率進行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗?；蛐秃偷任换蚺c疾病的關聯(lián)強度用OR和95%CI表示，計算OR及95% CI，檢驗均為雙側。

2 結果

2．1 一般資料的比較 兩組患者性別、年齡、體重指數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義。見表1?；颊呋€時HCV-RNA、肝功能、血脂等生化指標見表2。

表1　一般資料

表2　基線時的HCV-RNA、肝功能、血脂等生化指標［n（%）］

2．2 對HCV組和健康對照組基因多態(tài)性進行遺傳平衡檢驗 HCV組和健康對照組均符合Hardyweinberg平衡定律（P＝0.26、0．43），具有人群代表性。見表3。

表3　基因型和等位基因Hardy-Weinberg平衡定律檢驗

2．3 PCR產(chǎn)物電泳 PCR產(chǎn)物結果均在1.0%瓊脂糖凝膠，150 V、100 mA、30 min電泳下觀察，PCR產(chǎn)物均獲得高效和特異擴增。見圖1。

2．4 rs8099917、rs12979860位點基因型的判定和等位基因頻率在兩組間的分布 rs8099917在HCV組中TG／GG基因型頻率高于健康對照組（χ2＝11.627，P＝0.001），G等位基因頻率在兩組間差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝7.011，P＝0.008），通過計算OR和95%CI顯示其與HCV發(fā)病關聯(lián)強度，結果表明與TG／GG型相比，TT型可以降低HCV的易感風險；與T等位基因相比，G等位基因為HCV的易感基因。見表4。rs12979860CC、CT／TT基因型和HCV易感性無關聯(lián)（χ2＝0.043，P＝0.835），C等位基因頻率和T等位基因頻率與HCV易感性差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.280，P＝0.596）。見表5。

表4　rs8099917位點基因型的判定和等位基因頻率在兩組間的分布

表5　rs12979860位點基因型的判定和等位基因頻率在兩組間的分布

2．5 分析中國維吾爾族HCV慢性感染者rs8099917、rs12979860基因型頻率與其他民族的差

異 rs8099917TT基因型頻率從高到低依次是臺灣［9］、韓國［7］、中國漢族［9］、中國維吾爾族、日本［8］、歐洲［2］。見表6。rs12979860CC型頻率在中國維吾爾族患者中相對較低，與歐洲人群相當，明顯低于亞洲HCV肝炎人群。見表7。

表6　中國丙型肝炎患者rs8099917基因型頻率與其他民族的差異

表7　中國維吾爾族丙型肝炎患者rs12979860基因型頻率與其他民族的差異

2．6 HCV組中不同IL-28B基因型的人群中HCV-RNA載量、肝功能和血脂分析 HCV組中，rs12979860CC純合子中的HCV-RNA高于CT／TT型的人群，二者間差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.032）；對rs8099917分析時發(fā)現(xiàn)，其與HCV病毒載量無關聯(lián)；兩位點分組比較中ALT、AST以及血脂差異均無統(tǒng)計學意義。

3 討論

全球約有3%的人口感染HCV，是慢性肝病的主要病因，這些患者面臨著肝硬化和肝細胞癌的威脅［1］。研究［10］表明，宿主因素可能在HCV感染發(fā)展過程中起非常大的作用，包括感染年齡、性別、體重指數(shù)、種族以及宿主基因等。近年有研究［2－3］顯示，位于人19號染色體上IL-28B與HCV易感性以及治療應答密切相關。宿主遺傳差異是HCV感染后轉(zhuǎn)歸的一個重要岡素，約有20～30%的急性HCV感染者能夠自發(fā)的清除病毒，但是大部分感染者仍然會發(fā)展成慢性丙肝患者［3］。即使外來的HCV感染源相同，對病毒的清除能力也有明顯的個體差異，宿主基因在HCV易感性方面起到很大作用。GWAS研究將與HCV感染預后關聯(lián)的基因鎖定在IL-28B，其中rs8099917和rs12979860是最受關注的兩個位點。

Ge et al［2］發(fā)現(xiàn)歐洲人群中攜帶rs12979860非CC型基因更易發(fā)展為慢性HCV，CC型基因被認為是保護性基因，Thomas et al［3］驗證了rs12979860與病毒清除存在著關聯(lián)，然而本研究中rs12979860在HCV慢性感染人群和健康人群的分布差異無統(tǒng)計學意義。Rauch et al［11］發(fā)現(xiàn)攜帶rs8099917TT型的患者較非TT型患者在HCV易感性方面有明顯的優(yōu)勢；亞洲人群的研究中，Ochi et al［8］在日本人群中發(fā)現(xiàn)HCV患者rs8099917T等位基因明顯低于健康人群；米寅等［9］研究內(nèi)地漢族HCV人群與健康人群發(fā)現(xiàn)rs8099917G為HCV感染的風險等位基因，這都與本研究得出的結論一致，即rs8099917T等位基因在HCV人群中的分布低于健康人群，T等位基因可能為HCV感染的保護性基因。日本學者［8］發(fā)現(xiàn)rs8099917與日本HCV感染者療效的關聯(lián)性強于rs12979860。進一步研究［12］發(fā)現(xiàn)，HCV易感性研究同樣涉及IL-28B SNP位點，這表明HCV易感性與抗病毒治療清除涉及同樣的遺傳背景，而相比rs12979860而言，rs8099917似乎更適用于亞洲人群［10］。

此外，rs12979860在維吾爾族HCV慢性感染人群與其他種族的對比分析中發(fā)現(xiàn)，維吾爾族慢性HCV患者rs12979860TT型明顯低于東亞人群，與歐洲人群［2］的基因型頻率相近，在健康人群的研究［7］中顯示rs12979860分型顯示東亞人C等位基因頻率達92%，歐洲人群中70%；而維吾爾族人群為78%，同樣介于東亞人群和歐洲人群之間。還比較了維吾爾族rs8099917基因型與其他種族分布的差異，維吾爾丙型肝炎患者rs8099917基因型分布與中國漢族［6］、日本人群［8］相似，保護基因型頻率低于臺灣［9］、韓國［7］和中國漢族人群［6］。然而在歐洲丙型肝炎患者中，TT基因型頻率僅為58%［11］。rs8099917 T等位頻率［12］在維吾爾族人群達到93%、亞洲人為92%、歐洲人為83%?？梢姡S吾爾族人群保護性基因型頻率高于白種人，與東亞人群相當，維吾爾族人群和東亞人群的HCV易感性要低于歐洲人群，這種現(xiàn)象也許可以在某種程度上解釋亞洲人群HCV患者抗病毒治療應答效果好于白種人［13］。

對IL-28B位點的多態(tài)性與HCV病毒核酸的關系進行了研究，對基因lb型的HCV患者進行分析

顯示CC基因型患者中HCV載量明顯高于CT／TT基因型患者，而對感染HCV基因型2a型的患者進行分析尚未發(fā)現(xiàn)有差異。本研究中顯示攜帶rs12979860非CC基因型的患者，HCV病毒載量低于攜帶CC基因型的患者，這可能是因為維吾爾族HCV感染者大多為1b型有關。但實驗中并未對HCV基因分型進行研究，故結論尚需要進一步調(diào)查和證實。有研究［14］證實HCV感染后的各項生化指標和細胞炎癥證明與IL-28B基因型可能有關，研究［15］中報道了攜帶有CC基因型的人群有更高的低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇水平，但本研究中發(fā)現(xiàn)并未發(fā)現(xiàn)上述關聯(lián)。

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Genetic polymorphisms of interleukin-28B associated with susceptibility to hepatitis C virus infection

Liu Xiang1，2，Zhang Jinying2，Zhang Yongping2，et al
（1The Affiliated Xinjiang Hospital of Anhui Medical University，Urumchi 830001；2People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumchi 830001）

AbstractObjective To study the association between interleukin-28B（IL-28B）single nucleotide polymorphism and susceptibility to hepatitis C virus（HCV）infection in Xinjiang Uyghur populition．Methods In this study，the IL-28B rs8099917 and rs12979860 locus were genotyped in 180 patients infected with HCV and 150 healthy controls using the method of direct gene sequencing．To analyze the differences of SNPs genotypes and allele frequencies in two groups，SPSS 13．0 was used．Results ①TT and TG／GG genotype frequencies of rs8099917 differed significantly between patients with chronic HCV and healthy controls（χ2＝11.627，P＝0.001，OR＝1.363，95% CI：1.107～1.591）．Patients with HCV infection had a higher G allele frequency than healthy controls（χ2＝7.011，P＝0.008，OR＝0.658，95%CI：0.512～0.905）．②rs12979860 polymorphisms was not significantly associated with the susceptibility to HCV infection in Xinjiang Uyghur populition．Conclusion The IL-28B rs8099917 gene polymorphism correlates with susceptibility to HCV infection in Uyghur patient．G allele is associated with a higher risk of HCV infection．

Key wordsinterleukin-28B；hepatitis C；gene polymorphisms；susceptibility

作者簡介：劉 祥，男，碩士研究生；仲英娜，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：zhongyn2005＠126．com

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院院內(nèi)科研項目（編號：20130304、20130202）

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0437－04

中圖分類號R 512．62；R 394．31