董 勇，趙永忠，肖緒華，劉燕秀，李 彩，成秋宸

荔枝核總黃酮對(duì)活化大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖抑制作用及TLR4表達(dá)的影響

董 勇，趙永忠，肖緒華，劉燕秀，李 彩，成秋宸

摘要目的 研究荔枝核總黃酮（TFL）在體外對(duì)活化的大鼠肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）的增殖抑制作用及Toll樣受體4 （TLR4）表達(dá)的影響。方法 使用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）（5 ng／ml）激活HSC-T6，顯微鏡下觀察HSC-T6和激活的HSC-T6形態(tài)變化；CCK8試劑盒（CCK8）法觀察TFL作用24、48、72 h后活化的HSC-T6的增殖情況；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)HSC-T6中TLR4的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。結(jié)果 顯微鏡下觀察HSC-T6和激活的HSC-T6形態(tài)有明顯變化；CCK8結(jié)果顯示TFL可以抑制HSC-T6的增殖（P＜0.05），并且隨著TFL濃度和作用時(shí)間增加，HSC-T6增殖明顯下降，呈濃度依賴性；RT-PCR結(jié)果顯示隨著TFL濃度增加，HSC-T6中TLR4表達(dá)下降，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明TFL阻滯細(xì)胞于S期，G0／G1期細(xì)胞減少（P＜0.05），S期細(xì)胞增加（P＜0.05），促進(jìn)細(xì)胞的凋亡（P＜0.05），呈濃度依賴性。結(jié)論 TFL可以抑制HSC-T6的增殖，其作用機(jī)制可能是通過(guò)降低TLR4在HSC-T6中的表達(dá)，阻滯其細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗肝纖維化效果。

關(guān)鍵詞荔枝核總黃酮；肝星狀細(xì)胞；TLR4；細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞術(shù)

2015－01－12接收

作者單位：桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，桂林 541001

肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源，在肝纖維化形成中起關(guān)鍵性作用，HSCs通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子影響并加速肝纖維化的進(jìn)程［1］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外圍繞以促進(jìn)HSCs凋亡和膠原降解為靶標(biāo)的抗肝纖維化研究成為熱點(diǎn)，為肝纖維化的防治尋找突破口。研究［2］表明Toll樣受體4（Toll-like receptors4，TLR4）／核因子-κB （nuclear factor-kappaB，NF-κB）信號(hào)通路為肝損傷時(shí)重要的肝細(xì)胞凋亡途徑之一。該實(shí)驗(yàn)探討荔枝核總黃酮（total flavone of litchi chinensis sonn，TFL）在體外對(duì)活化的大鼠肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）的增殖抑制作用及其機(jī)制，進(jìn)一步探討肝纖維化的發(fā)生機(jī)制，同時(shí)為TFL應(yīng)用于臨床治療肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器 HSC-T6（中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究細(xì)胞庫(kù)）；TFL濃度為60%（南京澤郎生物有限公司）；高糖型的DMEM液體培養(yǎng)基；含有EDTA的胰蛋白酶和無(wú)EDTA的胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國(guó)Hyclone公司）；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）（美國(guó)Peprotech公司）；CCK8 （cell cunting Kit-8）購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）反應(yīng)體系：總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒及擴(kuò)增試劑盒（中國(guó)天根生物有限公司）；Markers（北京康為生物科技有限公司）；流式凋亡試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；流式周期試劑盒（碘化吡啶、RNA酶）；梯度PCR儀（德國(guó)Sigma公司）；倒置相差顯微鏡（德國(guó)蔡司）酶標(biāo)儀；MLDEL680（美國(guó)伯樂(lè)公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司產(chǎn)品）；TLR4及β-actin引物由美國(guó)Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成。

1．2 實(shí)驗(yàn)分組 2 μgTGF-β1溶解于10 μl pH＝3.0濃度為10 mmol／L的檸檬酸，配成0.2 mg／ml的TGF-β1母液；稱取60 mgTFL溶解于1 ml（100 μl DMSO＋900 μl 10%FBS的培養(yǎng)基）溶液中，配成1 ml的80 mg／ml的TFL母液，然后稀釋成實(shí)驗(yàn)需要的不同濃度的藥物樣品的培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為7組：①空白對(duì)照組：10%FBS的DMEM培養(yǎng)基；②實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：10%FBS的DMEM培養(yǎng)基＋5 ng／ml TGF-β1；③TFL80組：10%FBS的DMEM培養(yǎng)基＋5 ng／ml TGF-β1＋80 μg／ml TFL；④TFL160組：10%FBS 的DMEM培養(yǎng)基＋5 ng／ml TGF-β1＋160 μg／ml TFL；⑤TFL320組：10%FBS的DMEM培養(yǎng)基＋5 ng／ml TGF-β1＋320 μg／ml TFL；⑥TFL640組：10% FBS的DMEM培養(yǎng)基＋5 ng／ml TGF-β1＋640 μg／

ml TFL；⑦TFL800組：10%FBS的DMEM培養(yǎng)基＋5 ng／ml TGF-β1＋800 μg／ml TFL。

1．3 細(xì)胞培養(yǎng) HSC-T6在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，用體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS、質(zhì)量濃度均為100 μg／ml的青霉素、鏈霉素的高糖培養(yǎng)基，2 d傳代1次。

1．4 CCK-8法檢測(cè)TFL對(duì)活化的HSC-T6增殖抑制率 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6消化傳代，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2.5×104／ml密度接種于3塊96孔板，每孔100 μl。細(xì)胞貼壁后換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后換成含有不同濃度TFL的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加10 μl的CCK-8溶液。恒溫箱培養(yǎng)45 min，酶標(biāo)儀于450 nm處檢測(cè)吸光度（absorbance，A），計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖抑制率，分析不同時(shí)間不同濃度的TFL對(duì)細(xì)胞增殖的影響程度。

1．5 RT-PCR檢測(cè)HSC-T6中TLR4的表達(dá) 按照前述方法不同濃度樣品干預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞分組，培養(yǎng)細(xì)胞48 h。TLR4（上游引物：5′-TGCCTGAGACCAGGAAGCTTG-3′，下游引物：5′-CTTAAGATCTTCAGG GGGTTG-3′），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為152 bp；β-actin（上游引物：5′-AGGTGACAGCAGTCGGTTGG-3′，下游引物：5′-CGAAGGCTCATCATTCAAAA-3′），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為300 bp。TLR4及β-actin引物的退火溫度均為55℃，34個(gè)循環(huán)。總RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR均按說(shuō)明書操作。取5 μl的PCR產(chǎn)物，1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鈍化分離，凝膠成像分析儀下觀察拍照，并應(yīng)用SensiAnsys凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1．6 AnneXin V-7AAD／PE雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按照前述方法不同濃度樣品干預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞分組，培養(yǎng)細(xì)胞48 h，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，1 500 r／min離心10 min，收集細(xì)胞，棄上清液；PBS沖洗1次，1 500 r／min離心10 min，棄上清液，加入200 μl的緩沖液重選細(xì)胞；避光加入10 μl的AnneXin V-7AAD，室溫避光孵育15 min，上機(jī)前加5 μl 的PE，補(bǔ)加300 μl的PBS緩沖液，混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，MAfit LT3．3分析軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1．7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 細(xì)胞藥物處理方法如上，用0．02%的胰酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，2 000 r／min離心10 min，棄上清液，PBS沖洗2次，棄上清液，加1 ml PBS懸浮細(xì)胞，在振蕩器上緩慢加入3 ml的冰無(wú)水乙醇，4℃冰箱過(guò)夜保存固定細(xì)胞。次日，2 000 r／min離心10 min，PBS沖洗1次，每個(gè)樣本加入500 μl體積分?jǐn)?shù)為50 μg／ml的PI，100 μg／ml RNAse，重懸細(xì)胞，37℃避光孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)分析。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示。多樣本間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)以α＝0.05。

2 結(jié)果

2．1 HSC-T6與其形態(tài)學(xué)變化 正常HSC-T6與被TGF-β1誘導(dǎo)后活化的HSC-T6常規(guī)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察，形態(tài)有明顯差異。HSC-T6分散生長(zhǎng)，而被TGF-β1激活的HSC-T6島狀聚簇生長(zhǎng)。見圖1。

2．2 TFL抑制HSC-T6的增殖 隨著TFL濃度和作用時(shí)間增加，HSC-T6增殖明顯下降且具有量效關(guān)系。TFL組A值與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1　各組HSC-T6的A值（±s）

表1　各組HSC-T6的A值（±s）

F1：同一時(shí)間點(diǎn)組間A值比較；F2：組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)A值比較；與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較：＃P＜0.05；與TFL80組比較：ΔP＜0.05；與TFL160組比較：＆P＜0.05

組別　24 h　48 h　72 h　F2值空白對(duì)照＜0．05 0．884±0．062　0．863±0．014　0．849±0．082　0．345實(shí)驗(yàn)對(duì)照　0．973±0．078　0．985±0．013　1．074±0．166*　1．099 TFL80　0．829±0．054　0．847±0．037?！?．770±0．086＃　1．712 TFL160　0．812±0．030?！?．828±0．026?！?．726±0．090＃　3．665 TFL320　0．777±0．063?！?．723±0．083＃　0．716±0．031?！?．284 TFL640　0．716±0．063*＃　0．649±0．088*＃Δ＆　0．611±0．041*＃2．967 TFL800　0．711±0．078*?！?．643±0．080*＃Δ＆　0．609±0．070*＃2．057 F1值，P值　8．374，＜0．05　18．861，＜0．05　15．757，

2．3 TFL抑制HSC-T6中TLR4的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，空白對(duì)照組中TLR4的表達(dá)有明顯差別，TLR4／β-actin比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000）；TFL組隨著培養(yǎng)液中TFL濃度增加，HSC-T6中TLR4的表達(dá)有明顯趨勢(shì)，

TLR4／β-actin比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝146.081，P＝0.000）。見圖2、3。

2．4 TFL對(duì)HSC-T6凋亡和周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示TFL阻滯細(xì)胞于S期，G0／G1期細(xì)胞減少（P＜0.05），S期細(xì)胞增加（P＜0.05），促進(jìn)細(xì)胞的凋亡（P＜0.05），具有濃度依賴性。見表2、3，圖4、5。

表2　各組細(xì)胞的凋亡率（%，±s）

表2　各組細(xì)胞的凋亡率（%，±s）

F：同一時(shí)間點(diǎn)組間細(xì)胞總凋亡率比較；與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較：＃P＜0.05；與TFL80組比較：ΔP＜0.05；與TFL160組比較：＆P＜0.05；與TFL320組比較：οP＜0.05；與TFL640組比較：¤P＜0.05

組別　　早期凋亡率　　晚期凋亡率　　細(xì)胞總凋亡率空白對(duì)照4．13±0．31　4．17±0．40　8．30±0．70實(shí)驗(yàn)對(duì)照　1．47±0．35　3．80±0．40　5．27±0．75 TFL80　9．30±0．35*＃　5．50±0．50　14．80±0．61*＃TFL160　14．80±0．26*＃Δ　12．97±0．15*＃Δ　27．77±0．31*＃ΔTFL320　19．73±1．17*＃Δ＆　11．17±0．76*＃Δ　30．90±1．01*＃ΔTFL640　32．10±2．46*＃Δ＆ο　19．83±1．46*＃Δ＆ο　51．93±3．26*＃Δ＆οTFL800　36．23±1．62*＃Δ＆ο¤　23．17±1．04*＃Δ＆ο¤　59．40±2．65*＃Δ＆ο¤F值，P值　360．318，＜0．05　284．748，＜0．05　457．936，＜0．05

表3　各組細(xì)胞的周期百分比（%，±s）

表3　各組細(xì)胞的周期百分比（%，±s）

F：同一時(shí)間點(diǎn)組間細(xì)胞作用時(shí)期比較；與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較：＃P ＜0.05；與TFL80組比較：ΔP＜0.05；與TFL160組比較：＆P＜0.05；與TFL320組比較：οP＜0.05

組別　G1期　S期　G2期空白對(duì)照組74．54±3．55　18．03±3．93　7．43±0．56實(shí)驗(yàn)對(duì)照組　75．82±3．62　15．06±3．89　9．12±0．69 TFL80組　63．90±1．39*?！?7．53±2．01*＃　8．57±1．47 TFL160組　57．37±1．57*＃Δ　32．68±2．34*?！?．95±1．54 TFL320組　54．84±0．95*＃Δ　36．06±0．80*＃Δ　9．10±1．61 TFL640組　46．15±0．41*＃Δ＆ο　47．18±2．73*＃Δ＆ο　6．68±3．11 TFL800組　44．83±1．59*＃Δ＆ο　49．92±1．72*＃Δ＆ο　5．25±1．32＆F值，P值　128．920，＜0．05　3．919，＜0．05　97．532，＜0．05

3 討論

肝纖維化的形成是一個(gè)極為復(fù)雜的生理病理過(guò)程，牽涉到致病機(jī)體反應(yīng)、細(xì)胞因子、反應(yīng)靶細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)物過(guò)量表達(dá)、抑制因素、降解酶等多種因素的作用。目前的研究［3-4］證實(shí)HSCs的激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并分泌細(xì)胞外基質(zhì)是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。而研究［5］表明HSCs的激活與內(nèi)毒素有關(guān)，脂多糖可能直接激活HSCs，與其表面的TLR4結(jié)合并進(jìn)而激活NF-κB和JNK信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)，從而促使了纖維化的形成［6］。Paik et al［7］發(fā)現(xiàn)活化的HSCs表達(dá)TLR4和其輔助受體髓樣分化蛋白2和CD14。研究［8-9］顯示，TLR4可上調(diào)各類趨化因子（單核趨化蛋白1、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1α、庫(kù)普弗細(xì)胞、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1β、調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2、干擾素誘導(dǎo)蛋白10）和TLR2的表達(dá)，而通過(guò)接頭蛋白髓樣細(xì)胞分化因子途徑和NF-κB途徑下調(diào)靜止的HSCs的TGF-β仿真受體Bambi （BMP and the activin memebrane-bound inhibitor）來(lái)增加TGF-β介導(dǎo)的HSC活化及其膠原的產(chǎn)生，促進(jìn)肝纖維化。研究［10－11］證明TLR4和NF-κB可以在膽管阻塞型大鼠肝組織內(nèi)高表達(dá)，大劑量TFL可以通過(guò)抑制大鼠組織TLR4和NF-κB的表達(dá)，改善膽管阻塞型肝大鼠纖維化程度。HSC-T6是否高表達(dá)TLR4以及TLR4對(duì)HSC-T6的生物學(xué)活性有什么影響尚需進(jìn)一步研究。

研究［7］證明來(lái)活化的HSCs中TLR4表達(dá)水平很低，不表達(dá)髓樣分化蛋白2和CD14；活化的HSCs 中TLR4、髓樣分化蛋白2和CD14表達(dá)明顯增加。本實(shí)驗(yàn)將活化的HSC-T6作為靶點(diǎn)，采用不同時(shí)間不同濃度的TFL作用于HSC-T6。RT-PCR結(jié)果顯示HSC-T6在mRNA水平上可以表達(dá)TLR4，隨著藥物濃度增加，TLR4的表達(dá)降低，呈濃度依賴性。進(jìn)一步觀察TLR4與HSC-T6增殖和凋亡的關(guān)系，CCK8及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示TFL阻滯細(xì)胞于S期即DNA合成期，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，降低TLR4的表達(dá)可以促進(jìn)HSC-T6的凋亡［12－13］。實(shí)驗(yàn)證明TFL通過(guò)降低TLR4在HSC-T6中的表達(dá)，阻滯細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗肝纖維化效果。

從白樺樹中提取的BA通過(guò)抑制TLR4／MyD88／NF-κB信號(hào)通路，有顯著的抗纖維化作用［14］。MyD88抑制劑ST2825治療肝纖維化也有較好的療效［15］。隨著對(duì)TLR4更深入的研究，其通路將成為抗纖維化治療的新的突破點(diǎn)。TFL作為此信號(hào)傳導(dǎo)藥物研究的一個(gè)熱點(diǎn)，其抗肝纖維化具有顯著療效［10－11，16－18］。但是其對(duì)人類HSCs的增殖是否有抑制作用及具有抗纖維化效果，尚需進(jìn)一步研究。

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The total flavone of litchi chinensis sonn inhibits the proliferation of actived hepatic stellate cells via the TLR4 pathway in rats

Dong Yong，Zhao Yongzhong，Xiao Xuhua，et al
（The Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001）

AbstractObjective To investigate the anti-proliferative effect of total flavone of litchi chinensis sonn（TFL）on the activated hepatic stellate cells（HSC-T6）in vitro and the influence on Toll-like receptors 4（TLR4）．Methods HSC-T6 were activated with TGF-β（5 ng／ml）and then divided into the following groups：blank control，experimental control，five experimental groups．Different morphological changes of HSC-T6 and HSC-T6 were observed under the microscope．CCK8 was used to observe the proliferation of three kinds of the activated HSC-T6 which had been respectively affected by TFL for 24，48 and 72 h．The expressions of TRL4 were detected by RT-PCR（for mRNA）．The cell cycle and cell apoptosis were detected by flow cytometry（FCM）．Results There were obvious morphological changes of HSC-T6 and HSC-T6 under the microscope．The results of CCK8 showed that TFL could inhibit the proliferation of HSC-T6（P＜0.01），and HSC-T6 decreased significantly with the increase of the concentration and action time of TFL．It could be found in the results of RT-PCR that expressions of TLR4 of HSC-T6 declined with the increase of TFL concentration．There were visible differences compared with the experimental control（P＜0.01）．The test of FCM showed that TFL retarded the cells during PeriA S，G0／G1cells reduce（P＜0.01）and then promoted the apoptosis of cells（P＜0.01）．So it depended on the concentration of TFL．Conclusion TFL can inhibit the proliferation of HSC-T6，whose mechanism is to inhibit the proliferation of cells and induce the cell apoptosis by reducing the expressions of TLR4 in HSC-T6，so as to have the effect of anti-liver fibrosis．

Key wordstotal flavone of litchi chinensis sonn；hepatic stellate cells；Toll-like receptors 4；cell apoptosis；flow cytometry

作者簡(jiǎn)介：董 勇，男，碩士研究生；趙永忠，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：13607736670＠163．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81360659）；廣西自然科學(xué)基金（編號(hào)：2012GXNSFAA053105）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）04－0432－05

中圖分類號(hào)R 575