陳亞軍，鐘 警，楊 靖，文格波

PRMT2及其剪接體在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位及意義

陳亞軍1，2，3，鐘 警1，楊 靖1，文格波1

摘要目的 構(gòu)建蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2（PRMT2）及其差異剪接體與綠色熒光蛋白（GFP）的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染后觀察其融合蛋白在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位，為進(jìn)一步研究PRMT2基因及其新的差異剪接體在乳腺癌中的作用奠定基礎(chǔ)。方法 以pGEM-T-PRMT2／α／β／γ載體為模板，設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增目的基因，并將PCR產(chǎn)物克隆至pcDNA3．1／NT-GFP-topo載體，轉(zhuǎn)化后將陽性克隆擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行跑膠鑒定和測序。提取pcDNA3．1／NT-GFP-PRMT2／α／β／γ及空載體pcDNA3．1／NT-GFP質(zhì)粒，用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下，觀察外源性PRMT2／α／β／γ融合蛋白在MCF-7細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。采用Western blot法檢測各重組融合蛋白在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果 各GFP在細(xì)胞中均有表達(dá)，但其在細(xì)胞中的分布位置不一致。PRMT2α與PRMT2γ的融合蛋白同PRMT2的分布一致，均聚集于核仁外的核漿，胞質(zhì)中有少許分布；而PRMT2β和空載體的熒光蛋白的分布一致，都均勻分布于細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核，包括核仁部分。Western blot法檢測表明各重組融合蛋白在MCF-7細(xì)胞中均有表達(dá)。結(jié)論 PRMT2及其各剪接體的亞細(xì)胞定位不同，可能提示其在功能方面存在差異。

關(guān)鍵詞乳腺癌；蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2；剪接體；亞細(xì)胞定位

2015－01－13接收

作者單位：1南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，衡陽 421001

2南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，衡陽 4210013南華大學(xué)病理生理學(xué)教研室，衡陽 421001

乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率在我國呈逐年上升趨勢［1］。在影響乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的諸多因素中，雌激素起著重要的作用，雌激素能與雌激素受體（estrogen receptor，ER）結(jié)合，激活含雌激素反應(yīng)元件基因的表達(dá)［2］。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2（protein arginine methyltransferase 2，PRMT2）作為一種新的ERα共激活子，在非洲綠猴腎COS-7細(xì)胞中能以激素依賴的方式提高ERα的轉(zhuǎn)錄活性［3］。本研究在前期工作中發(fā)現(xiàn)了PRMT2的3種新的差異剪接體，并分別將其命名為PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ（GenBank登陸號分別為FJ436410、FJ436411、FJ436412）。為了探索PRMT2基因新的剪接體是否與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)，該研究采用基因轉(zhuǎn)染的方法，分別觀察PRMT2及其各剪接體融合蛋白在乳腺癌MCF-7細(xì)胞株中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位，為進(jìn)一步研究PRMT2及其新的剪接體在乳腺癌中的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞株、質(zhì)粒及主要試劑 JM109菌種、pGEM-T-PRMT2／α／β／γ載體均為南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所保存；乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（Lipofect AMINETM2000）、pcDNA3．1／NT-GFP載體、TRIzol試劑均購自美國Invitrogen公司；Blue Ranger預(yù)染蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)購自美國Hyclone-Pierce公司；Cy3熒光素標(biāo)記羊抗兔二抗、兔抗人ERα多克隆一抗及辣根過氧化酶購自美國Santa Cruz公司；各種培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Sigma公司。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞采用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加0.1 mmol／L非必需氨基酸、1.0 mmol／L丙酮酸鈉、0.01 mg／ml牛胰島素、1.5 g／L碳酸氫鈉，細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1．3 PRMT2及其剪接體綠色熒光蛋白（green fluorescent portein，GFP）重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 以本實驗室保存的pGEM-T-PRMT2／α／β／γ載體為模板，擴(kuò)增PRMT2基因全長引物為上游：5′-ATG GCAACATCAGGTGACT-3′，下游：5′-TCATCTCCAGATGGGGAA-3′；擴(kuò)增PRMT2α基因引物為上游：5′-ATGGCAACATCAGGTGACT-3′，下游：5′-TCAACT

GTCATCTCCAG-3′；擴(kuò)增PRMT2β基因引物為上游：5′-ATGGCAACATCAGGTGACT-3′，下游：5′-TCATCACCCCTCAAGATAT-3′；擴(kuò)增PRMT2γ基因引物為上游：5′-ATGGCAACATCAGGTGACT-3′，下游：5′-TCATCTCCAGATGGGGAAGA-3′；PCR反應(yīng)體系為20 μl，其中上下游引物各1 μl，模板1 μl，2×Tag PCR Master Mix 10 μl，超純水7 μl，PCR儀上擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pcDNA3.1／NT-GFP-topo vector載體，反應(yīng)體系為5 μl，其中PCR產(chǎn)物3 μl，topo vector 1 μl，salt solution 1 μl，37℃連接1 h后轉(zhuǎn)化，將篩選的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，跑膠鑒定及測序（寶生物大連有限公司），Blast軟件進(jìn)行比對分析。

1．4 PRMT2及其剪接體蛋白的亞細(xì)胞定位觀察取對數(shù)生長期細(xì)胞按3.5×105／孔密度接種于培養(yǎng)板。待細(xì)胞貼壁生長融合約50%時，將pcDNA3.1／NT-GFP-PRMT2／α／β／γ及空載體表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞；具體操作參照Lipofect AMINETM2000說明書。48 h后，于室溫下細(xì)胞用3%多聚甲醛溶液固定10 min，0.1%Triton X-100穿透5 min，含Cy3標(biāo)記的ERα抗體孵育2 h，DAPI染核3 min，每個步驟開始前均加入PBS沖洗細(xì)胞2次，激光共聚焦顯微鏡觀察PRMT2及其剪接體蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

1．5 Western blot法檢測重組融合蛋白的表達(dá)用細(xì)胞裂解液裂解各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度，具體方法參照BCA蛋白定量試劑盒說明書。于100℃水浴10 min，取等量總蛋白SDSPAGE分離，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。TBST（含5%脫脂奶粉）封閉2 h后，加入兔抗人GFP多克隆一抗（1∶1 000）過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶4 000）室溫孵育60 min，化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，壓片顯影，分析PRMT2及其剪接體GFP融合蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2．1 PRMT2及其剪接體基因擴(kuò)增 成功擴(kuò)增出PRMT2及其剪接體基因全長，電泳鑒定PRMT2及其剪接體基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PRMT2擴(kuò)增條帶約為1 300 bp，PRMT2α與PRMT2β對應(yīng)條帶約900 bp，PRMT2γ擴(kuò)增條帶最小，約700 bp，與預(yù)計大小基本一致。見圖1。

2．2 外源性PRMT2及其剪接體蛋白的亞細(xì)胞定位 表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，8h后，用激光共聚焦顯微鏡觀察MCF-7細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染了PRMT2及其新剪接體的真核表達(dá)質(zhì)粒GFP的表達(dá)，結(jié)果顯示：剪接體PRMT2α與PRMT2γ融合蛋白的亞細(xì)胞分布同野生型PRMT2的分布一致，均聚集于核內(nèi)除核仁外的核漿部分，胞質(zhì)有少許分布。而PRMT2β則不同，融合蛋白均勻分布于胞質(zhì)和胞核，包括核仁部分，與空載體GFP蛋白的分布一致。見圖2。

2．3 Western blot法檢測重組融合蛋白的表達(dá) 蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜，X線片曝光并顯影和定影后觀察到轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1／NT-GFP-PRMT2／α／β／γ及空載體pcDNA3.1／NT-GFP都檢測到了條帶，表明各組融合蛋白在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)成功。見圖3。

3 討論

目前認(rèn)為，ERα信號途徑活性的改變在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，而ERα共調(diào)節(jié)因子的變化，是導(dǎo)致ERα信號途徑活性改變的重要原因。正常情況下，雌激素水平在絕經(jīng)后的婦女中是下降的，而ERα轉(zhuǎn)錄活性卻在絕經(jīng)后的乳腺癌患者中表現(xiàn)增強(qiáng)，雌激素主要通過與ERα結(jié)合促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。目前乳腺癌內(nèi)分泌治療主要通過降低體內(nèi)雌激素水平及抑制雌激素作用，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的，因此對ERα共調(diào)節(jié)因子的發(fā)現(xiàn)與研究對于指導(dǎo)乳腺癌內(nèi)分泌藥物的有效研發(fā)具有重要意義。

PRMT2屬于PRMTs的成員之一［3］，在人染色體上定位于21q22．3末端著絲粒的位置，編碼433個氨基酸。PRMT2能通過多種機(jī)制發(fā)揮不同的轉(zhuǎn)

錄調(diào)節(jié)作用，包括轉(zhuǎn)錄因子甲基化［4］、組蛋白甲基化［5］、RNA差異剪接等［6］，并參與細(xì)胞分化［7］、炎癥反應(yīng)［8］及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［9］等過程。PRMT2所起的多種生物學(xué)作用主要依賴于其N-末端的SH3結(jié)構(gòu)域。PRMT2主要通過直接黏附于ERα的AF-1或AF-2等結(jié)構(gòu)域來充當(dāng)ERα的共激活子，提高其轉(zhuǎn)錄活性［3］，然而PRMT2在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)形式、調(diào)控ERα信號途徑的機(jī)制，目前尚未清楚。研究［7］表明，PRMT2能阻斷IkB-α的核輸出，抑制NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PRMT2還能與視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因和E2F1結(jié)合，形成三體復(fù)合物來抑制E2F1轉(zhuǎn)錄活性，延緩細(xì)胞從G1期至S期的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［10］。這些結(jié)果均表明PRMT2可通過多種機(jī)制發(fā)揮不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。

高等真核細(xì)胞可以通過選擇性剪接使蛋白質(zhì)組產(chǎn)生多樣性，這是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制。從細(xì)胞生理、發(fā)育調(diào)控到疾病的發(fā)生發(fā)展都與選擇性剪接密切相關(guān)。近年的研究［11］表明，發(fā)生在編碼蛋白質(zhì)基因的差異性剪接與許多腫瘤的形成和發(fā)展密切相關(guān)，并且有些選擇性剪接是腫瘤所特有的。研究選擇性剪接的發(fā)生以及探索相應(yīng)蛋白異構(gòu)體的功能對于腫瘤的診斷和治療具有十分重要的意義。

為了探索PRMT2基因及其差異剪接體的功能，本研究構(gòu)建了PRMT2基因及其各差異剪接體的真核表達(dá)載體，利用基因轉(zhuǎn)染的方法來初步探討PRMT2及其剪接體的生物學(xué)功能。本研究通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染后采用Western blot法證實了MCF-7細(xì)胞中PRMT2及其剪接體融合蛋白均獲得較高表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48 h，用激光共聚焦顯微鏡觀察外源性PRMT2及其差異剪接體PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ融合蛋白在MCF-7細(xì)胞中GFP的表達(dá)，結(jié)果顯示PRMT2及其差異剪接體的融合蛋白在各組細(xì)胞中均有表達(dá)，但其分布位置不一致。由此推測，PRMT2及其剪接體之間出現(xiàn)的亞細(xì)胞定位差異很可能是由選擇性剪接引起的。PRMT2各差異剪接體在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中擁有不同的亞細(xì)胞定位，提示其生物學(xué)意義可能有所不同。PRMT2新的剪接體在體內(nèi)的作用如何，是否與其亞細(xì)胞定位有關(guān)，其差異剪接是否對ERα信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生影響，是否將成為一個新的腫瘤標(biāo)志物，有待于進(jìn)一步研究證實。

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Subcellular localization of PRMT2 gene and its splicings in breast cancer MCF-7 cells

Chen Yajun1，2，3，Zhong Jing1，Yang Jing1，et al
（1Institute of Clinical Medical Research，The First Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang 421001；2Dept of Endocrinology，The Second Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang 421001；3Dept of Pathophysiology，University of South China，Hengyang 421001）

AbstractObjective To construct eukaryotic expression vectors pcDNA3．1／NT-GFP-PRMT2 and its splicings pcDNA3．1／NT-GFP-PRMT2α／β／γ and transfected into breast cancer MCF-7 cells，observe the subcellular localization of GFP-fusion protein in order to investigate the role of PRMT2 and its splicings in breast cancer．Methods The PRMT2 and its splicings genes were amplified from the vectors pGEM-T-PRMT2／α／β／γ，then subcloned into pcDNA3．1／NT-GFP-topo vector and sequenced．The recombinant pcDNA3．1／NT-GFP-PRMT2／α／β／γ，were transfected into breast cancer MCF-7 cells by lipofectamine respectively．The expression of green fluorescent protein was observed under laser scanning microscope，and the expression levels of PRMT2α／β／γ fusion protein were indentified by western blot．Results The expression of GFP fusion protein of PRMT2 and its splicings were observed under the laser scanning microscope，indicating that PRMT2α and PRMT2γ GFP fusion protein resulted in the nuclei except the nucleolus，cytoplasm has diffusion to scatter，as well as that of PRMT2．PRMT2β and N-GFP protein showed scatter homogeneously in nuclei and cytoplasm．Western blot indicated the recombinant PRMT2 and its splicings PRMT2α／β／γ genes were respectively expressed in breast cancer MCF-7 cells．Conclusion The subcellular localization of PRMT2 and its splicings are different and which maybe suggests they that the distinct roles in breast cancer．

Key wordsbreast cancer；protein-arginine N-methyltransferase 2；splicings；subcellular localization

作者簡介：陳亞軍，女，碩士；文格波，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wen＿gb ＠hotmail．com

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目（編號：31200573）；湖南省自然科學(xué)基金資助項目（編號：13JJ6051）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0423－04

中圖分類號R 737．9