鄧琳 趙湜* 毛紅

武漢市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科

* 通訊作者：zhaoshiwuhan@126.com

自體干細(xì)胞治療在缺血性糖尿病足病中的應(yīng)用

鄧琳 趙湜* 毛紅

武漢市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科

* 通訊作者：zhaoshiwuhan@126.com

目的比較自體干細(xì)胞治療（autologous stem cell therapy，ASCT）和經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)（percutaneous transluminal angioplasty，PTA）治療缺血性糖尿病足病(ischemia diabetic foot，IDF)的效果。方法 84例IDF患者納入研究，28例患者進(jìn)行PTA治療，32例患者接受自體干細(xì)胞治療（外周血干細(xì)胞治療13例，骨髓干細(xì)胞治療19例），24例無(wú)法或不愿接受PTA或ASCT治療的患者作為對(duì)照組，隨訪12月，對(duì)截肢率、經(jīng)皮氧分壓（TcPO2）和傷口愈合進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果 隨訪6月和12月后ASCT和PTA組的截肢率顯著低于對(duì)照組（P=0.002和P=0.003），而ASCT和PTA組之間沒(méi)有顯著差異。對(duì)于TcPO2的改善，ASCT和PTA組之間也沒(méi)有顯著差異（二者均與基線相比P＜0.05），而對(duì)照組的TcPO2在隨訪期間無(wú)明顯升高。我們觀察到ASCT組的潰瘍愈合率高于PTA組和對(duì)照組（81.2%對(duì)55.2%與21.3%，P＜0.05）。結(jié)論 本研究表明ASCT 和PTA治療均能顯著降低IDF患者的截肢率，ASCT治療對(duì)于潰瘍愈合有更顯著的療效。本研究結(jié)果支持ASCT是一種潛在的極有前途的治療IDF的方法。

缺血性糖尿病足病，經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)，自體干細(xì)胞治療

近年來(lái)糖尿病患病率在全球呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)，糖尿病下肢缺血發(fā)病率將達(dá)到50%，糖尿病足病的發(fā)生率約為0.9%～1.7%，它是一種降低患者生活質(zhì)量、致殘率較高的糖尿病慢性并發(fā)癥，成為患者和社會(huì)的巨大負(fù)擔(dān)。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)將糖尿病足病定義為糖尿病患者因合并各種不同程度末梢血管病變和神經(jīng)病變導(dǎo)致下肢感染、潰瘍和/或深部組織破壞。傳統(tǒng)的糖尿病足病的治療方法包括藥物、血管搭橋、介入手術(shù)和截肢術(shù)等，尤其是血管搭橋術(shù)和腔內(nèi)血管重建介入手術(shù)可以顯著提高患者的保肢率。盡管如此，仍有近三分之一的患者因?yàn)閺V泛或位于遠(yuǎn)端動(dòng)脈閉塞而無(wú)法進(jìn)行血管搭橋術(shù)和腔內(nèi)血管重建介入手術(shù)，只能選擇藥物保守治療，因此新的治療技術(shù)，例如自體干細(xì)胞療法（ASCT），給這些“無(wú)法選擇”的患者帶來(lái)了希望。

正常狀態(tài)下，干細(xì)胞主要存在于骨髓中，外周血的干細(xì)胞數(shù)量?jī)H為骨髓中的0.1%～1%，CD34+細(xì)胞僅占外周血單個(gè)核細(xì)胞的0.01%～0.1%[1]。我們采用的是經(jīng)過(guò)分離和純化的自體骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞和外周血來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞，這兩種類型的干細(xì)胞已經(jīng)被用于肢體缺血性疾病的多個(gè)多中心隨機(jī)對(duì)照臨床研究中[2，3]。最近發(fā)表的薈萃分析表明，ASCT能改善肢體缺血，提高經(jīng)皮氧分壓（TcPO2）或踝肱指數(shù)，促進(jìn)傷口愈合，減輕患者疼痛，降低截肢率[4，5]。既往的臨床研究表明ASCT并不增加血清促血管生成細(xì)胞因子的水平和視網(wǎng)膜上新生血管形成的風(fēng)險(xiǎn)，也進(jìn)一步證實(shí)其安全性。我們研究的目的是比較ASCT與PTA和保守藥物治療IDF的療效。

研究對(duì)象和方法

我們納入84例2010年1月至2013年12月之間我院收治的IDF患者進(jìn)行這項(xiàng)回顧性研究，符合PTA治療適應(yīng)癥的患者納入PTA組（n=28），無(wú)法進(jìn)行血運(yùn)重建的患者則選擇ASCT（n=32）治療，對(duì)照組（n=24）選擇的是采取藥物保守治療的患者。

表1 各組基線特征

所有患者經(jīng)血管造影確診為下肢動(dòng)脈閉塞癥，足部潰瘍的嚴(yán)重程度按Wagner分級(jí)法處于3～4級(jí)，TcPO2＜30毫米汞柱或踝肱指數(shù)＜0.6。

干細(xì)胞治療的患者簽署書面知情同意書，并接受了入組前的檢查，包括腫瘤的篩查和血管造影檢查。所有患者均在我們的糖尿病足病門診隨訪治療。對(duì)于感染性潰瘍，我們根據(jù)藥敏試驗(yàn)采取適當(dāng)?shù)目股刂委?。合并有深靜脈血栓、腫瘤性疾病以及進(jìn)展性糖尿病視網(wǎng)膜病變的患者被除外。

ASCT包括骨髓干細(xì)胞治療（19例）和外周血干細(xì)胞治療（13例）。在既往的臨床研究中發(fā)現(xiàn)這兩類干細(xì)胞懸液治療肢體缺血性疾病的療效無(wú)顯著差異[6]。自體外周血干細(xì)胞治療應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）450～600μg/d皮下注射，連用5d，每天監(jiān)測(cè)血象變化。為防止高細(xì)胞血癥引起重要臟器血栓形成，當(dāng)WBC＞20×109/L時(shí)，應(yīng)用低分子肝素鈣4100U皮下注射。第5～6d用COBE Spectra Version 4血細(xì)胞分離機(jī)單采干細(xì)胞，配成1×108/ml細(xì)胞混懸液供移植用。自體骨髓干細(xì)胞治療應(yīng)用多側(cè)孔骨穿針?lè)謩e垂直穿刺兩側(cè)髂后上嵴，各抽取100ml骨髓液，送實(shí)驗(yàn)室行人工干細(xì)胞分離，配成1×108/ml細(xì)胞懸液供移植用。無(wú)論是骨髓干細(xì)胞還是外周血干細(xì)胞， 一旦分離純化后即可以將純化后富含CD34+的干細(xì)胞懸液在手術(shù)室靜脈麻醉后，無(wú)菌條件下，將干細(xì)胞懸液按3cm×3cm間距進(jìn)行肌肉注射，病變嚴(yán)重的按1cm×1cm間距注射到潰瘍傷口的邊緣。隨訪12月，對(duì)截肢率、經(jīng)皮氧分壓（TcPO2）和傷口愈合進(jìn)行了評(píng)估。

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)來(lái)表示，使用Mann-Whitney檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，P＜0.05為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

三組患者的年齡、性別、糖化血紅蛋白、糖尿病病程、合并癥以及下肢特征無(wú)顯著的差異。隨訪12月，ASCT組的32例患者中4例死亡，6例截肢；PTA組28例患者中，3例死亡，5例截肢；對(duì)照組的24例患者中，4例死亡，11例截肢。隨訪6月和12月ASCT和PTA組的截肢率顯著低于對(duì)照組（P=0.002和P=0.003），而ASCT和PTA組之間沒(méi)有顯著差異。

隨訪12月以后，TcPO2在兩個(gè)治療組的非截肢患者中有顯著增加（ASCT組15.3～39.5mmHg，PTA組16.2～41.2mmHg，二者均P＜0.05），而對(duì)照組中非截肢患者的TcPO2無(wú)顯著變化（14.1～15.9mmHg，P=NS）。ASCT組中截肢的5例患者中有3例是因?yàn)閲?yán)重的足部感染病原菌耐藥，盡管其TcPO2有明顯提升，仍然無(wú)法避免截肢。另2例患者由于缺血和感染的進(jìn)展最終選擇截肢。隨訪期間的ASCT組的傷口愈合率顯著高于PTA組和對(duì)照組，3個(gè)月相比（47.2%對(duì)23.5%與16.9%，P＜0.05），6個(gè)月相比（61.7%對(duì)32.5%與11.6%，P＜0.05）和12個(gè)月相比（81.2%對(duì)55.2%與21.3%，P＜0.05）。

表2 隨訪期TcPO2變化(mmHg)

ASCT組中無(wú)嚴(yán)重不良事件發(fā)生，PTA組中出現(xiàn) 1例嚴(yán)重急性出血事件。ASCT組中（n=7，21.8%）發(fā)生一般不良事件包括下肢水腫，骨髓采集后臀部血腫，PTA組（n=5，17.85%）中少數(shù)患者出現(xiàn)腹股溝區(qū)穿刺部位的裂開(kāi)。

討論

干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，可在一定條件下向特定類型的細(xì)胞分化。我們選用的骨髓干細(xì)胞和外周血干細(xì)胞屬成體干細(xì)胞，它是一種多能干細(xì)胞，具有不受倫理、法律限制，且免疫排斥低、腫瘤風(fēng)險(xiǎn)小等優(yōu)點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。自體干細(xì)胞治療肢體缺血性疾病主要是根據(jù)自體干細(xì)胞在一定條件下，可誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，同時(shí)合成分泌大量的促血管生成因子，形成新生血管的原理，以改善下肢血流。2002年Tateishi-Yuyama等[7]首次報(bào)道了應(yīng)用自體骨髓干細(xì)胞移植治療下肢缺血性疾病的臨床研究，結(jié)果顯示，側(cè)支循環(huán)顯著改善，未觀察到任何明顯的移植相關(guān)副作用。2008年谷涌泉等[8]采用局部肌肉注射和動(dòng)脈注射兩種方法，將骨髓原始單個(gè)核細(xì)胞移植到缺血肢體，兩組患者經(jīng)皮氧分壓、踝肱指數(shù)、側(cè)枝循環(huán)形成等客觀指標(biāo)都得到了提高，二者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。近幾年來(lái)， 外周血干細(xì)胞移植發(fā)展很快，也顯示出良好的療效。Kawamura等[9]采用自體外周血單個(gè)核細(xì)胞移植治療糖尿病或閉塞性動(dòng)脈硬化所致的下肢潰瘍，有效率達(dá)70%。國(guó)內(nèi)黃平平等[10]采用自體外周血單個(gè)核細(xì)胞移植治療14 例糖尿病肢體缺血患者，與對(duì)照組比較，潰瘍愈合加快，血流灌注、踝肱指數(shù)等客觀指標(biāo)提高，移植后沒(méi)有出現(xiàn)不良反應(yīng)。這些資料表明自體外周血單個(gè)核細(xì)胞移植是治療糖尿病下肢缺血的一種簡(jiǎn)單、安全、有效的新療法。張會(huì)峰等[11]報(bào)道了52例有糖尿病下肢血管病的患者采用骨髓干細(xì)胞移植和外周血干細(xì)胞移植治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在主觀和客觀療效評(píng)價(jià)方面均無(wú)明顯差異（P＞0.05），提示二種不同來(lái)源干細(xì)胞治療下肢缺血在血管新生方面療效相當(dāng)。2006年Vojtasslk J等[12]將自體骨髓細(xì)胞直接涂布于糖尿病足患者的潰瘍面，并且注射于創(chuàng)緣，明顯加速潰瘍的愈合。ASCT治療的益處在多個(gè)薈萃分析中也得以證實(shí)[13，14]。

PTA作為治療IDF的傳統(tǒng)療法其療效已被公認(rèn)。我們的研究顯示ASCT在IDF患者中獲得了堪比PTA手術(shù)的療效。與PTA和保守治療相比，ASCT后傷口愈合更快，可能是注射的干細(xì)胞和血管生長(zhǎng)因子共同作用的結(jié)果。對(duì)于生長(zhǎng)因子的研究最多的是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），研究表明VEGF 可以動(dòng)員干細(xì)胞的增生，動(dòng)員細(xì)胞在血管內(nèi)皮的微環(huán)境內(nèi)扎根從而加速傷口愈合。兩種積極治療的方法均優(yōu)于保守治療。

移植的干細(xì)胞是未分化細(xì)胞，是否會(huì)在移植部位分化成其他組織，是否會(huì)激發(fā)或者促進(jìn)體內(nèi)潛在惡性腫瘤及血管瘤的生長(zhǎng)，是否會(huì)促進(jìn)糖尿病眼底增殖病變的惡化，目前報(bào)道的臨床研究尚未觀察到嚴(yán)重不良反應(yīng)，但是由于樣本量較小，時(shí)間尚短，這些問(wèn)題仍需密切關(guān)注。我們的研究也未觀察到ASCT治療的任何嚴(yán)重的不良事件，也沒(méi)有任何證據(jù)提示增加腫瘤的發(fā)病率以及眼底增殖病變的惡化。截肢作為自體干細(xì)胞治療糖尿病足病的不良結(jié)果被認(rèn)為是糖尿病足和下肢缺血性疾病的臨床結(jié)局，而不是ASCT產(chǎn)生的不利影響。

感染是糖尿病足發(fā)生的誘導(dǎo)因素和加重因素，糖尿病足患者感染率達(dá)到58%。包括革蘭陽(yáng)性球菌、革蘭陰性桿菌在內(nèi)的多種需、厭氧細(xì)菌和真菌的混合感染。所有入選患者均根據(jù)藥敏結(jié)果給予抗生素進(jìn)行適當(dāng)?shù)目垢腥局委煟瑢?duì)潰瘍的愈合起到至關(guān)重要的作用。

我們的研究隨訪期12月，所有患者均在采用標(biāo)準(zhǔn)化方法在我中心治療，三組患者的臨床特征具有可比性。但這項(xiàng)研究的局限性在于它被設(shè)計(jì)為一個(gè)回顧性比較研究。

自體干細(xì)胞治療是治療糖尿病足病的的一項(xiàng)新技術(shù)，其在國(guó)內(nèi)外臨床研究中取得了廣泛認(rèn)可， 使一部分患者免于截肢的痛苦，提高患者的生活質(zhì)量。但這一技術(shù)的具體機(jī)制仍未完全闡明，遠(yuǎn)期是否有致瘤性等副作用，仍需進(jìn)一步前瞻性的臨床研究。

總之，在我們的臨床研究中發(fā)現(xiàn)自體干細(xì)胞治療糖尿病足病和對(duì)照組相比截肢率有顯著下降，同時(shí)加速潰瘍的愈合。這進(jìn)一步證實(shí)自體干細(xì)胞治療不僅用于肢體缺血性疾病，在改善傷口愈合方面是一種很有前途的方法。隨著對(duì)干細(xì)胞研究的不斷深入，干細(xì)胞在臨床的應(yīng)用前景越來(lái)越廣泛，將為糖尿病足病患者享受健康人生帶來(lái)希望。在干細(xì)胞移植選擇上，由于外周血與骨髓來(lái)源干細(xì)胞受數(shù)量、質(zhì)量及移植相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)等影響，臨床應(yīng)用中受到一定限制，將來(lái)需要進(jìn)一步深入干細(xì)胞的生物學(xué)特性、療程和致瘤性等方面研究，提高臨床治療的效果。

1 To LB， Haylock DN， Simmons PJ， Juttner CA. The biology and clinical uses of blood stem cells. Blood，1997，89(7)：2233-2258.

2 Powell RJ， Marston WA， Berceli SA， et al. Cellular therapy with ixmyelocel-T to treat critical limb ischemia： the randomized， doubleblind， placebo-controlled RESTORE-CLI Trial. Mol Ther，2012，20：1280-1286.

3 Prochazka V， Gumulec J， Jaluvka F， et al. Cell therapy， a new standard in management of chronic critical limb ischemia and foot ulcer. Cell Transplant，2010，19：1413-1424.

4 Fadini GP， Agostini C， Avogaro A. Autologous stem cell therapy for peripheral arterial disease meta-analysis and systematic review of the literature. Atherosclerosis，2010，209：10-17.

5 Lawall H， Bramlage P， Amann B. Stem cell and progenitor cell therapy in peripheral artery disease. A critical appraisal. Thromb Haemost， 2010，103：696-709.

6 Dubsky M， Jirkovska A， Bem R， et al. Both autologous bone marrow mononuclear cell and peripheral blood progenitor cell therapies similarly improve ischaemia in patients with diabetic foot in comparison with control treatment. Diabetes Metab Res Rev，2013，29：369-376.

7 Tateishi-Yuyama E，Matsubara H， Murohara T，et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells： a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet，2002，360(9331)： 427-435.

8 Gu YQ， Zhang Jian， Guo LR，et al.Transplantation of autologous bone marrow mononuclear cells for patients with lower limb ischemia. Chinese Medical J， 2008，121(11)：963-967.

9 Kawamura A， Horie T， Tsuda I， et al. Prevention of limb amputation in patients with limbs ulcers by autologous peripheral blood mononuclear cell implantation. Ther Apher Dial，2005，9(1)：59-63.

10 Huang P， Li S， Han M， et al.Autologous Transplantation of Granulocyte Colony-Stimulating Factor Mobilized Peripheral Blood Mononuclear Cells Improves Critical Limb Ischemia in Diabetes.Emerging Treatments and Tec hnologies，2005，28(9)：2155-2160.

11 Zhang Hui-feng， Zhao Zhi-gang. Comparison of autologous peripheral blood stem cell and bone marrow stem cell transplantation in the treatment of 52 cases of diabetic peripheral arterial occlusive disease. The Chinese tissue engineering research and clinical rehabilitati on，2009，13(6)：1109-1112.

12 Prochzka V，Gumulec J， Chmelovt J，et a1.Autologous bone marrow stem cell transplantation in patients with end-stage chronical critical limb ischemia and diabetic foot.Vnitr Lek，2009，55(3)：173-178.

13 Powell RJ， Marston WA， Berceli SA， et al. Cellular therapy with ixmyelocel-T to treat critical limb ischemia： the randomized， doubleblind， placebo-controlled RESTORE-CLI Trial. Mol Ther，2012，20：1280-1286.

14 Teraa M， Sprengers RW， van der Graaf Y， et al. Autologous bone marrow-derived cell therapy in patients with critical limb ischemia：a meta-analysis of randomized controlled clinical trials. Ann Surg，2013，258：922-929.

10.3969/j.issn.1672-7851.2015.08.011