夏 澤，姜 賀，李洪龍

(延邊大學農(nóng)學院，吉林延吉 133002)

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MS糖對雞源乳酸桿菌生物學特性的影響

夏 澤，姜 賀，李洪龍*

(延邊大學農(nóng)學院，吉林延吉 133002)

[目的] 為MS糖在飼料添加劑中的應用提供可靠的理論依據(jù)。[方法]從健康成年雞腸道中分離乳酸桿菌, 并進行生理生化指標測定，研究在體外培養(yǎng)條件下MS糖對雞源乳酸桿菌生物學特性的影響。[結果] MS糖添加量3%～6%是乳酸桿菌生長最適的濃度范圍。當MS糖添加量為4%時，乳酸桿菌產(chǎn)酸速率相對較快，產(chǎn)酸量有所提高，耐酸性和耐熱性均顯著增強。[結論] MS糖對乳酸桿菌的生物學特性有一定的影響，作為一種新型的功能性低聚糖在家禽飼養(yǎng)中具有廣泛的開發(fā)前景。

MS糖；乳酸桿菌；生理生化指標；生物學特性

MS糖由韓國Mexcell Bio 研究所研制成功并于2013年申請專利(專利號：10-1302119)，是一種提高體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)吸收率的輔助食品用功能液。同時，是一種制作工藝簡單，價格低廉并具有廣泛開發(fā)前景的新型功能性低聚糖，其顯著功能之一是具有活化腸內(nèi)有益菌，促進其代謝產(chǎn)物的吸收和利用及抑制病原微生物在腸壁的附殖。乳酸菌是畜禽腸道中的優(yōu)勢菌群之一，由于乳酸菌在其生長過程中產(chǎn)生的乳酸菌素具有改善畜禽胃腸道功能、提高免疫力、改善機體營養(yǎng)狀況等作用，因此乳酸菌在畜禽消化道中出現(xiàn)和定植的早晚是機體生長和對疾病抵抗力的重要因素[1-4]。但是，在自然環(huán)境條件下大部分乳酸菌的定植能力差，對外界環(huán)境的耐熱性及耐酸性不強，這就限制其發(fā)揮有效的生物學功效[5]。因此，筆者從成年健康雞腸道中分離優(yōu)化乳酸桿菌后，在體外培養(yǎng)條件下添加不同濃度梯度的MS糖，研究其最適濃度范圍內(nèi)的MS糖對乳酸桿菌的生長曲線、產(chǎn)酸性、耐酸性及耐熱性等生物學特性的影響，以期為今后MS糖作為新型功能性低聚糖的一種被廣泛應用于飼料添加劑提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1培養(yǎng)基。①MRS培養(yǎng)基：七水硫酸鎂0.58 g、四水硫酸錳0.25 g、檸檬酸氫二銨2 g、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、酵母膏5 g、牛肉膏10 g、吐溫 80 1 ml。以上組分加入1 000 ml蒸餾水即為液體培養(yǎng)基，另加入適量瓊脂粉，即制成固體培養(yǎng)基。pH為6.2～6.4。滅菌條件為：121 ℃，15 min。②乳酸菌篩選培養(yǎng)基(2%CaCO3-MRS固體平板)：普通固體 MRS 培養(yǎng)基的基礎上加 2%的無水碳酸鈣，115 ℃下滅菌 20 min。

此外，明膠基礎培養(yǎng)基、硫化氫試驗培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、各類糖發(fā)酵培養(yǎng)基等生理生化鑒定培養(yǎng)基均按照文獻[6]中方法配制。

1.1.2生化試劑。革蘭氏染色試劑、雙氧水、甲基紅指示劑等。以上所用培養(yǎng)基和試劑均按照乳酸菌要求在實驗室內(nèi)配制。

1.1.3MS糖。MS糖由韓國Mexcell Bio 研究所提供。

1.2 試驗動物3月齡健康三黃雞3只，購自延吉市西市場。

1.3 方法

1.3.1測定指標與方法。

1.3.1.1乳酸桿菌的分離。按照以下步驟分離乳酸桿菌：解剖—采樣—處理—稀釋—涂板—鑒別—革蘭氏染色鏡檢—純化培養(yǎng)。

1.3.1.2生理生化指標的測定。將分離到的菌種分別進行明膠液化試驗、觸酶試驗、甲基紅試驗、硫化氫試驗、淀粉水解試驗、運動性試驗、糖酵解反應(葡萄糖、甘露醇、蔗糖、纖維二糖、棉籽糖、水楊苷、七葉苷、麥芽糖)等，進行菌種的初步鑒定。

1.3.1.3MS糖添加量最適范圍的測定。菌種活化后，按5%的接種量分別接種于含有不同濃度的MS糖(0、0.1%、0.2%～0.9%、1%～10%)共20個濃度梯度的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h后用分光光度計測定OD600值。以OD600均值為縱坐標，以MS糖濃度為橫坐標，繪制濃度曲線。

1.3.1.4生長曲線的繪制。菌種活化后，按5%的接種量分別接種于含有不同濃度(0、最適濃度范圍)MS糖的MRS液體培養(yǎng)基中，每組3個重復，37 ℃下厭氧培養(yǎng)，每隔2 h取樣1次，使用分光光度計測定OD600值。以OD600均值為縱坐標，以時間為橫坐標，繪制生長曲線。

1.3.1.5產(chǎn)酸性的測定。菌種活化后，按5%的接種量分別接種于含有不同濃度MS糖的MRS液體培養(yǎng)基中，每組3個重復，37 ℃下厭氧培養(yǎng)，每隔2 h取樣1次，使用酸度計測定pH值。以pH均值為縱坐標，以時間為橫坐標，繪制產(chǎn)酸性曲線圖。

1.3.1.6耐酸性試驗。菌種活化后，按5%的接種量分別接種于含有不同濃度MS糖的MRS液體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基pH調(diào)整為2.0和6.8，每組3個重復，分別培養(yǎng)2、4、6、8 h后取樣200 μl，稀釋后取 10-4、10-5、10-6倍稀釋液，分別涂布 MRS平板培養(yǎng)，37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h后進行平板法計數(shù)，計算活菌率。

N酸(%)=nx/n0×100%

(1)

式中,N酸為經(jīng)過pH 2.0處理后不同時間的乳酸桿菌存活率；n0為經(jīng)過pH 6.8處理2、4、6、8 h后涂布的每毫升活菌數(shù)；nx為經(jīng)過pH 2.0處理2、4、6、8 h后涂布的每毫升活菌數(shù)。

1.3.1.7耐熱性試驗。菌種活化后，按5%的接種量分別接種于含有不同濃度MS糖的MRS液體培養(yǎng)基中，每組3個重復，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后分別置于40、60和80 ℃，3個梯度的水浴中，均處理10、20、30 min后取樣200 μl，稀釋后取 10-4、10-5、10-6倍稀釋液，分別涂布 MRS平板培養(yǎng)，37 ℃下厭下氧培養(yǎng)24 h后進行平板法計數(shù)，計算活菌率。

N熱(%)=nx/n0×100%

(2)

式中,N熱為經(jīng)過40、60、80 ℃處理后不同時間的乳酸桿菌存活率；n0為經(jīng)過40、60、80 ℃處理前涂布的每毫升活菌數(shù)；nx為經(jīng)過40、60、80 ℃處理后涂布的每毫升活菌數(shù)。

1.3.2數(shù)據(jù)處理。試驗數(shù)據(jù)用Excel軟件整理和繪圖，并使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P<0.05差異顯著，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 乳酸桿菌的分離與形態(tài)學觀察經(jīng)溶鈣圈法篩選出的菌株在純化培養(yǎng)后的菌落呈乳白色，邊緣整齊， 半球凸起實心， 表面光滑，菌落較小。革蘭氏鏡檢結果為陽性，染色后呈藍紫色，菌體呈長桿狀，無芽孢，不運動，稍彎曲，成對或單個存在(圖1)。

2.2 乳酸桿菌的生理生化鑒定結果乳酸桿菌的生理生化鑒定結果見表1。

表1 乳酸桿菌的生理生化鑒定結果

注：“+”表示90%以上菌株為陽性，“-”表示90%以上菌株為陰性。

2.3 MS糖添加量的最適范圍從圖2可以看出，MS糖為0.1%～2.0%濃度時，OD值都明顯低于對照組，且不穩(wěn)定，從3.0%濃度時開始逐步上升，并有明顯波峰，當MS糖6.0%濃度時呈逐漸穩(wěn)定下降趨勢，因此初步確定最適合乳酸桿菌生長的MS糖添加量范圍為3.0%～6.0%。

2.4 生長曲線從圖3可以看出，MS糖濃度為4%時，OD值始終高于其他組，說明產(chǎn)菌量最多，且從4 h后OD值明顯增長，直到16 h后OD值逐漸穩(wěn)定在2.18左右，而對照組在最高時OD值僅在1.9左右，與其他組相比較低，說明添加不同濃度的MS糖可使乳酸桿菌的產(chǎn)菌量提高。

2.5 產(chǎn)酸性從圖4可以看出，在培養(yǎng)的不同階段，MS糖濃度為4%與5%組的pH均低于對照組，且二者基本相同，3%組與6%組pH基本相同，但與對照組差異不大；各組基本均從4 h開始進入加速期，16 h后進入恒定期，但添加量為4%濃度時，曲線下降較快，說明其產(chǎn)酸速率較其他組稍快，當添加量為5%時產(chǎn)酸量較多，pH最低值趨近于3，說明添加MS糖對乳酸桿菌的產(chǎn)酸性稍有影響。

2.6 耐酸性試驗由表2可知，隨著時間的推移，各組存活率均下降，當培養(yǎng)液pH為2，培養(yǎng)2 h后試驗2組與對照組和試驗4組差異顯著，分別提高了9.13%和7.70%；4 h，對照組與試驗各組之間均差異顯著，各試驗組之間差異不顯著；6 h，試驗1、2和4組較對照組存活率分別提高了43.38%、47.21%和36.38%，差異顯著；8 h，試驗2組存活率達到14.42%，與對照組、試驗1組和試驗4組均差異顯著，對照組與試驗1組合試驗3組差異不顯著。

表2 不同添加量MS糖對乳酸桿菌耐酸性的影響 %

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P﹤0.05)。

2.7 耐熱性試驗由表3可知，隨著溫度與時間的增加，各組存活率均降低，經(jīng)40 ℃水浴處理 10、20和30 min 后，各菌株的存活率均在 95%以上；經(jīng)60 ℃處理 10 min 后，各組之間存活率相似，差異不顯著；經(jīng)60 ℃處理 20 min 后，對照組存活率僅為21%，與其他組差異顯著；經(jīng)60 ℃處理 30 min 后，試驗組與對照組差異顯著，分別提高了160%、140%、146%和99.9%；經(jīng)80 ℃處理10 min后，對照組存活率為0，與試驗組差異顯著，試驗2組存活率達到4.33%，比其他試驗組差異顯著；經(jīng)80 ℃處理20 min后，試驗2組存活率為1.33%，其他組存活率均為0，差異顯著；經(jīng)80 ℃處理30 min后，各組存活率為0。

表3 不同添加量MS糖對乳酸桿菌耐熱性的影響 %

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P﹤0.05)。

3 結論與討論

國內(nèi)外研究表明，乳酸桿菌為雞消化道內(nèi)優(yōu)勢菌群之一。它是兼性厭氧菌，無氧或較低的氧分壓環(huán)境下在固態(tài)基質(zhì)表面生長；最適生長溫度為35～38 ℃，20 ℃以下基本不生長，耐熱性差；最適 pH 為 5.5～6.0，耐酸性強，能在其他乳酸菌不能生長的環(huán)境中生長繁殖；營養(yǎng)要求復雜，需要氨基酸、肽、核酸衍生物、鹽類脂肪酸或脂肪酸脂類和可發(fā)酵的碳水化合物，能利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖等一些單糖和寡糖進行同型發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)生 DL 型乳酸。乳酸桿菌生長繁殖需要一定的維生素等生長因子，適宜生長溫度下培養(yǎng)生長緩慢，生產(chǎn)周期長[7]。由于人體或動物消化道內(nèi)沒有可以降解功能性低聚糖的酶，因此功能性低聚糖不能被人體或動物消化道內(nèi)的酶降解而順利到達大腸，選擇性地促進腸道內(nèi)有益菌雙歧桿菌、乳酸菌的增殖，抑制有害菌大腸桿菌等的增殖[8]。筆者從健康雞腸道中分離細菌，經(jīng)形態(tài)學觀察及生理生化鑒定發(fā)現(xiàn)明膠液化試驗、觸酶試驗、甲基紅試驗、硫化氫試驗、淀粉水解試驗、吲哚試驗及除麥芽糖酵解外的糖酵解反應結果都呈陰性，因此初步鑒定其為乳酸桿菌；在體外培養(yǎng)條件下首先確定MS糖添量的最適濃度范圍在3%～6%，結果表明濃度過低時與對照組差別不大，濃度過高的MS糖對乳酸桿菌的生長稍有抑制作用，因?qū)S糖作用機制的報道國內(nèi)尚未見報道，但大多低聚糖都存在這樣的情況，這與萬榮峰等[9]的研究結果相似，可能是因為高濃度的低聚糖在培養(yǎng)基中形成了高的滲透壓，對細菌產(chǎn)生了一定的脫水作用，抑制了其生長，濃度過低促進作用又不明顯；隨后分別對其生長曲線和產(chǎn)酸性進行測定，結果表明，無論是產(chǎn)菌量還是產(chǎn)酸性，都在培養(yǎng)的4～16 h有較快增長，從16 h后逐漸進入穩(wěn)定期，與對照組相比試驗組OD600值更高，尤其當添加量為4%時，OD600值最高可達2.18，pH值穩(wěn)定在3.2左右，表明產(chǎn)菌量增加，產(chǎn)酸更快，產(chǎn)酸量更多，這與杭蘇琴等[10]研究結果相一致；在耐酸性試驗中，盡管培養(yǎng)液pH為2，但在培養(yǎng)初始的2 h內(nèi)，對照組與試驗組存活率均能達到90%左右，差別不大，隨著時間的增加，各組的菌株存活率成倍數(shù)下降；到第8 h只有MS糖添加量為4%時，存活率達到14.42%，其他組均在10%以下，對照組更低至于1.24%，與大多數(shù)研究[11-13]相比,也是具有較好的耐受性。這說明添加適量的MS糖可顯著提高乳酸桿菌的耐酸性；在耐熱性試驗中，大多數(shù)研究表明最適乳酸桿菌生長溫度為 35～38 ℃[14]，因此此次試驗共設置40、60和80 ℃ 3個溫度梯度培養(yǎng)菌株，在40和60 ℃水浴中，乳酸桿菌均表現(xiàn)出較好的生長狀態(tài)，在80 ℃水浴中20 min后，存活率基本為0，僅在MS糖添加量為4%時，存活率為1.33%，說明此次分離出的乳酸桿菌有對熱較高的耐受性，這與周明等[15]的研究結果相一致，而且添加適量的MS糖后使乳酸桿菌對熱的耐受能力更強。

筆者初步確定MS糖添加量為3%～6%是乳酸桿菌生長最適的濃度范圍。當添加量在4%時，其產(chǎn)酸速率明顯加快，產(chǎn)酸量也有提高，耐酸性和耐熱性均有顯著增強。這說明MS糖對乳酸桿菌的生物學特性有一定的影響，作為一種新型的功能性低聚糖在家禽飼養(yǎng)中具有廣泛的開發(fā)前景。

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Effect of MS Oligosaccharides on the Biological Characteristics of Lactobacillus from Chicken

XIA Ze, JIANG He, LI Hong-long*

(Agricultural College of Yanbian Universit, Yanji， Jilin 133002)

[Objective] The research aimed to provide reliable theoretical basis for the application of MS oligosaccharides in feed additive. [Method] Lactobacillus was separated from the intestinal tract of adult health chicken. And their physiological and biochemical indices were determined. The effects of MS oligosaccharides on the biological characteristics of Lactobacillus from chicken under culture conditions in vitro were studied. [Result] The suitable adding amount of MS oligosaccharides for the growth of Lactobacillus was 3%-6%. When the adding amount of MS oligosaccharides was 4%，the acid production rate of Lactobacillus was faster，acid production increased and acid resistance and heat resistance were significantly enhanced. [Conclusion] MS oligosaccharides had some effects on the biological characteristics of Lactobacillus. MS oligosaccharides could be used as a new kind of functional oligosaccharide in the breeding of poultry, which had a broad development foreground.

MS oligosaccharides; Lactobacillus; Physiological and biochemical indices；Biological characteristics

夏澤(1990-)，女，吉林農(nóng)安人，碩士研究生，研究方向：低聚糖的生物活性及應用。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事動物營養(yǎng)方面的教學與科研工作。

2014-12-15

S 181.3

A

0517-6611(2015)04-089-04