田建平，張名楠，陳國(guó)良，張吉貞，胡遠(yuǎn)艷*

(1.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南?？?571199；2.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南?？?570228；3.海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228)

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紅外指紋圖譜和聚類(lèi)分析法在山銀花(華南忍冬)產(chǎn)域分類(lèi)鑒別中的應(yīng)用

田建平1，張名楠2，陳國(guó)良2，張吉貞3，胡遠(yuǎn)艷3*

(1.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南?？?571199；2.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南?？?570228；3.海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228)

[目的]研究紅外指紋圖譜在山銀花產(chǎn)域鑒別中的可行性。[方法]以山銀花(華南忍冬)的紅外指紋圖譜(紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)譜)為依據(jù)，采用聚類(lèi)分析對(duì)來(lái)自6個(gè)產(chǎn)地(海南和廣東)的華南忍冬進(jìn)行了分析。[結(jié)果]藥材粉末的一維紅外光譜分析表明，?？?、湛江和韶關(guān)3個(gè)產(chǎn)地與其他3個(gè)產(chǎn)地(文昌、瓊中、屯昌)在某些化學(xué)成分方面有著較顯著的差異，表現(xiàn)為湛江區(qū)具有3 407 cm-1特征吸收峰，韶關(guān)區(qū)具有1 637 cm-1特征吸收峰，第3號(hào)海口區(qū)和韶關(guān)區(qū)分別為具有1 066、1 074 cm-1特征吸收峰，?？凇⒄拷蜕仃P(guān)區(qū)具有611、610和 615 cm-1特征吸收峰；而另外3個(gè)地域(文昌、瓊中和屯昌)的華南忍冬化學(xué)成分則較相似；根據(jù)聚類(lèi)分析結(jié)果可將6個(gè)產(chǎn)地分為四類(lèi)。[結(jié)論]紅外光譜可為藥材的質(zhì)量控制和產(chǎn)區(qū)鑒別提供一個(gè)快捷、準(zhǔn)確、可行的鑒別方法。

紅外光譜；聚類(lèi)分析；二階導(dǎo)數(shù)圖譜；產(chǎn)域鑒別；山銀花

華南忍冬[Loniceraconfusa(Sweet)DC.]為忍冬科多年生藤本植物，主要分布在廣東、廣西、海南等地，花蕾或剛開(kāi)放的花供藥用，為華南地區(qū)“山銀花”中藥材的主要基源之一[1]。華南忍冬所含化學(xué)成分較多，如有機(jī)酸(綠原酸、異綠原酸、咖啡酸)、棕櫚酸等揮發(fā)油成分、黃酮類(lèi)化合物、三萜皂苷類(lèi)化合物。由于受地理生態(tài)和種質(zhì)遺傳等多方面因素的影響，不同產(chǎn)區(qū)華南忍冬的化學(xué)組成也不盡相同，最終致使其具有不同的藥效和藥性。因此，有必要對(duì)藥材產(chǎn)區(qū)進(jìn)行鑒別以便于對(duì)藥材市場(chǎng)進(jìn)行質(zhì)量控制，同時(shí)提高藥材的質(zhì)量。紅外光譜具有分析速度快、多種成分同時(shí)分析、無(wú)污染的優(yōu)點(diǎn)，其樣品不需特別的預(yù)處理，無(wú)損傷分析、操作簡(jiǎn)單、分析成本低，因此是一種重要的分析技術(shù)。 近年來(lái)紅外光譜技術(shù)已在中藥材鑒定、 中藥材炮制、中藥注射劑等相關(guān)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[2-6]。目前，有關(guān)不同產(chǎn)地華南忍冬中綠原酸和總黃酮含量測(cè)定的研究較多，但僅用較單一性指標(biāo)成分還不足以區(qū)分和鑒別華南忍冬的產(chǎn)區(qū)和質(zhì)量[7-9]。該研究擬借助于紅外光譜的指紋特性，用聚類(lèi)分析法對(duì)產(chǎn)于海南和廣東的華南忍冬進(jìn)行產(chǎn)區(qū)聚類(lèi)，探討其在分析、鑒別華南忍冬不同產(chǎn)區(qū)的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料于2013年期間分別從海南(海口、文昌、屯昌和瓊中)、廣東(湛江和韶關(guān))等地進(jìn)行山銀花藥材樣品采集，樣品由海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院楊衛(wèi)麗副教授鑒定為山銀花，其基源為來(lái)自忍冬科植物華南忍冬[Loniceraconfusa(Sweet)DC.]的干燥花蕾或剛開(kāi)放的花。 憑證標(biāo)本保存于海南醫(yī)學(xué)院中藥標(biāo)本館。冷凍干燥后藥材經(jīng)過(guò)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩備用。

1.2 儀器紅外光譜特征比較研究所用儀器為粉末壓片機(jī)769YP-15A(中國(guó))；紅外光譜儀Bruker TGA-IR(德國(guó))。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣品處理。取冷凍干燥后恒重的山銀花藥材粉末約3 mg，與200 mg 溴化鉀(優(yōu)級(jí)品)混合研磨均勻，利用粉末壓片機(jī)壓片。

1.3.2紅外光譜分析。試驗(yàn)研究所用檢測(cè)器分辨率為4 cm-1；檢測(cè)范圍4 000～400 cm-1；掃描信號(hào)累加 16 次，OPD速度為 0.2 cm/s；掃描時(shí)實(shí)時(shí)扣除水和二氧化碳的干擾。放入KBr壓片樣品之前，掃描紅外光譜儀聯(lián)用軟件“背景單通道”；放入KBr壓片樣品后，掃描“樣品單通道”，然后通過(guò)基線校正，13點(diǎn)平滑，獲取其紅外光譜原始圖，并標(biāo)峰。每樣品連續(xù)測(cè)定3次。利用OMNIC 8.0軟件數(shù)據(jù)處理導(dǎo)數(shù)圖譜功能，13點(diǎn)平滑，求得其二階導(dǎo)圖譜(600～1 750 cm-1)。

1.3.3聚類(lèi)分析。根據(jù)相應(yīng)波數(shù)位置光譜峰的有無(wú)，對(duì)山銀花藥材的紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行編碼，對(duì)相應(yīng)位置沒(méi)有紅外峰編碼為“0”，有紅外峰則編碼為“1”，然后利用 SPSS13.0軟件的類(lèi)間平均鏈鎖方法(Between Group Linkage)對(duì)其進(jìn)行聚類(lèi)分析，二值歐氏距離平方(Binary Squared Euclidean Distance)測(cè)度方法計(jì)算其相似性，并構(gòu)建不同產(chǎn)地山銀花藥材聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于一維紅外光譜的不同產(chǎn)地山銀花的比較通過(guò)傅立葉變換紅外光譜測(cè)定法獲得了山銀花(華南忍冬)入藥部位的一維紅外光譜圖，由來(lái)自不同產(chǎn)地的山銀花(華南忍冬)入藥部位紅外光譜分層圖(圖1)可知，不同產(chǎn)區(qū)的山銀花(華南忍冬)入藥部位的一維紅外光譜圖整體上較相似，其共同吸收波數(shù)為2 922～2 927、2 853～2 857、1 378～1 383、1 315～1 318、1 259～1 262 cm-1；不同之處在于湛江區(qū)具有3 407 cm-1波數(shù)，其他5個(gè)產(chǎn)區(qū)位于3 417～3 424 cm-1；韶關(guān)區(qū)具有1 637 cm-1波數(shù)，其他5個(gè)產(chǎn)區(qū)位于1 631～1 632 cm-1，?？趨^(qū)和韶關(guān)區(qū)分別為1 066、1 074 cm-1波數(shù)，其他4個(gè)產(chǎn)區(qū)位于1 050～1 054 cm-1；另外?？凇⒄拷蜕仃P(guān)區(qū)具有611、610和 615 cm-1波數(shù)，其他3個(gè)產(chǎn)區(qū)位于602～603 cm-1，說(shuō)明不同產(chǎn)區(qū)的同一種山銀花藥材其化學(xué)成分存在差異。

結(jié)合有關(guān)資料，通過(guò)對(duì)圖1的譜帶所對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)進(jìn)行歸屬和分析后發(fā)現(xiàn)，2 922～2 927 cm-1波數(shù)附近存在-C-CH2-C不對(duì)稱(chēng)-C-H伸縮的吸收峰，2 853～2 857 cm-1波數(shù)附近存在-CH2烷鍵對(duì)稱(chēng)伸縮的吸收峰，有可能是多糖、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)化合物等；1 631～1 632 cm-1波數(shù)附近存在黃酮等化合物中的不飽和C-C鍵的吸收峰，1 378～1 383 cm-1波數(shù)存在-CH3吸收峰；1 315～1 318 cm-1波數(shù)附近存在-OH面內(nèi)變形振動(dòng)的吸收峰，1 153～1 158 cm-1波數(shù)附近存在胺類(lèi)物質(zhì)中C-N伸縮振動(dòng)與醇類(lèi)或酚類(lèi)物質(zhì)中C-O單鍵伸縮振動(dòng)的吸收峰等；610 cm-1波數(shù)附近可能存在芳香類(lèi)化合物中C-H面外彎曲振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰。由該紅外光譜可說(shuō)明所在樣品里可能含有酚類(lèi)、醇類(lèi)、黃酮類(lèi)、蛋白質(zhì)等化學(xué)成分。

2.2 基于二階紅外光譜的不同產(chǎn)地山銀花的比較及聚類(lèi)分析利用OMNIC 8.0軟件對(duì)紅外導(dǎo)數(shù)圖譜功能，得到了不同產(chǎn)區(qū)山銀花的二階導(dǎo)數(shù)圖譜(600～1 750 cm-1)(圖2)。由圖2可知，6種來(lái)自不同產(chǎn)區(qū)的山銀花(華南忍冬)藥材的紅外光譜經(jīng)轉(zhuǎn)換為二階導(dǎo)數(shù)圖譜后，其重疊的吸收峰被分開(kāi)，但其中絕大部分峰仍然相似，表明它們是來(lái)自同一種植物，但在某些峰方面也存在顯著差別，如廣東湛江區(qū)具有1 582 cm-1波數(shù)，其他5個(gè)產(chǎn)區(qū)均為1 568～1 569 cm-1；廣東韶關(guān)區(qū)具有1 044和1 188 cm-1波數(shù)，其他5個(gè)產(chǎn)區(qū)則無(wú)該波數(shù)。因此說(shuō)明來(lái)自不同地域的山銀花(華南忍冬)其化學(xué)成分存在一定差異。進(jìn)一步根據(jù)其光譜特征利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件做聚類(lèi)分析，得到不同產(chǎn)區(qū)山銀花聚類(lèi)分析圖(圖3)，可以將6個(gè)產(chǎn)區(qū)分為4組，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論，因此可以根據(jù)紅外光譜特征區(qū)別山銀花(華南忍冬)的不同產(chǎn)區(qū)。

3 結(jié)論與討論

直接測(cè)定相關(guān)材料粉末的紅外光譜，所獲得的譜圖是各化合物吸收強(qiáng)度的疊加，與總體成分有關(guān)，具有指紋性。借助該指紋圖譜，可利用相關(guān)方法對(duì)其產(chǎn)區(qū)進(jìn)行聚類(lèi)和鑒別?，F(xiàn)有報(bào)道已說(shuō)明紅外圖譜在對(duì)藥材所含的化學(xué)成分進(jìn)行鑒別時(shí)所具有的多方面的優(yōu)點(diǎn)[2-3]。該研究通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地山銀花(華南忍冬)的藥材進(jìn)行紅外光譜分析，其一維紅外光譜鑒定結(jié)果呈現(xiàn)了海南?？趨^(qū)、廣東湛江區(qū)和韶關(guān)區(qū)均有較特殊的波數(shù)，在二階導(dǎo)數(shù)譜圖中，特別是在1 600～1 000

cm-1波數(shù)范圍內(nèi)差異較明顯，這種結(jié)果可能與不同產(chǎn)區(qū)所在的地理環(huán)境不同，特別是海口、湛江等地具有特殊的火山巖等土壤有關(guān)，因此可利用紅外光譜特點(diǎn)，根據(jù)其具體吸收峰的位置將6種產(chǎn)地的山銀花(華南忍冬)區(qū)分為4組，也進(jìn)一步證實(shí)了利用紅外光譜技術(shù)和聚類(lèi)分析可為藥材的質(zhì)量控制和產(chǎn)區(qū)鑒別提供一個(gè)快捷、準(zhǔn)確、可行的鑒別方法。

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The Application in Identification and Classification in Production Domain of Lonicerae Flos by Using FTIR Fingerprint and Cluster Analysis

TIAN Jian-ping1, ZHANG Ming-nan2,CHEN Guo-liang2,HU Yuan-yan3*et al

(1.Department of Paharmacy,Hainan Medical College,Haikou,Hainan 571199;2.Materials and Chemical Engineering,Hainan University, Haikou,Hainan 570228;3.Key Laboratory for Tropical Biological Resources,MOE,Hainan University,Haikou,Hainan 570228)

[Objective]The research aimed to study the feasibility in identification on region of Lonicerae Flos by using FTIR fingerprint methods.[Method]According to the FTIR fingerprint of Lonicerae Flos(Loniceraconfusa) including infrared spectroscopy and second derivative spectrum,the samples of medicinal materials from six areas both Hainan and Guangdong province had been analyzed by using cluster analysis methods.[Result]One dimensional infrared spectroscopy analysis of medicinal materials power showed that three areas (Haikou,Zhanjiang,Shaoguan) had more differences in chemical composition among of all areas.And the Zhanjiang with 3 407 cm-1, Shaoguan with 1 637 cm-1, Haikou and Shaoguan, respectively, for the 1 066 cm-1and 1 074 cm-1, also the Haikou,Zhanjiang and Shaoguan with 611, 610 and 615 cm-1. While the other three regions were similar to each other in chemical composition.According to the results of cluster analysis of six areas could be divided into four categories.[Conclusion]Infrared spectroscopy could provide a fast, accurate and feasible method for the identification of medicinal materials quality control and identifying regions.

FTIR;Cluster analysis;Second derivative spectrum;Regions identification;Lonicerae Flos

海南省教育廳科學(xué)基金資助項(xiàng)目(Hjkj2012-29)。

田建平(1972- )，男，湖南常德人，副教授，博士，從事中藥資源學(xué)研究。*通訊作者，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事中藥及藥理學(xué)研究。

2014-12-16

S 567

A

0517-6611(2015)04-112-03