樂佳美，熊筱娟，畢寶寶，陸文銓

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院，上海 200003；2.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春 336000；3.河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南開封 475000)

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RP-HPLC測定不同產(chǎn)地白蘞藥材中沒食子酸的含量

樂佳美1，2，熊筱娟2，畢寶寶3，陸文銓1*

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院，上海 200003；2.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春 336000；3.河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南開封 475000)

[目的]建立白蘞藥材中沒食子酸的RP-HPLC含量測定方法，為白蘞藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)。[方法]采用Dikma Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈- 0.2%磷酸(3∶97)為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫。流速為1.0 ml/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為270 nm。[結(jié)果]沒食子酸檢測濃度在3.15～202 μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999 9)；平均回收率為102.8%，RSD為1.15%。[結(jié)論]該方法快速，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，操作簡便，可用于白蘞藥材的質(zhì)量控制。

白蘞；沒食子酸；反相高效液相色譜法；質(zhì)量控制

白蘞(Ampelopsisjaponica( Thunb·)Makino)，葡萄科植物，又名野葡萄秧、鵝抱蛋、白草等。據(jù)《中藥大辭典》記載，白蘞以塊根入藥，具有清熱解毒、生肌止疼、消腫的功效，既可內(nèi)服，又可外敷，主要用于醫(yī)治癰腫瘡瘍、燙傷、扭挫傷等[1-2]。臨床廣泛應(yīng)用于治療化膿性皮膚感染、細(xì)菌性痢疾等疾病，療效顯著[3-4]?，F(xiàn)代研究表明白蘞中主要含有沒食子酸、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、蘆薈大黃素、羽扇豆醇等化合物，沒食子酸為白蘞中抗菌、抗病毒的主要藥效成分，且其含量較高[5-6]。目前在藥典中，白蘞藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有定性分析而無定量分析。為更好地控制白蘞生藥材質(zhì)量，更好地利用白蘞生藥資源和適應(yīng)中藥現(xiàn)代化的發(fā)展要求，該研究基于2015年版《中國藥典》科研課題，采用定量研究白蘞中沒食子酸含量的高低來評(píng)價(jià)白斂生藥材質(zhì)量，以期為制定白蘞藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對(duì)象。白蘞干燥藥材由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院藥材科提供，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院陳萬生教授鑒定為白蘞A.japonica。

1.1.2主要儀器。Agilent 1260 HPLC系統(tǒng)(Agilent Technologies，美國)，包括G1311A四元泵、G1322A真空脫氣機(jī)、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱和G4212B DAD檢測器，使用Chem Station軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；BAS124S-CW萬分之一電子分析天平(Sartorius，德國)；BP110S十萬分之一電子分析天平(Sartorius，德國)；XW-01定時(shí)可調(diào)速漩渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；KUDOS SK7200H 超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；TDL-4A 低速離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)；AG 22331 Humberg超高速離心機(jī)(Eppendorf，德國)；Eppendorf Research plus 可調(diào)量程移液器(Eppendorf，德國)。

1.1.3主要試劑。沒食子酸對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用，批號(hào)110831-201204)；甲醇和乙腈均為色譜純試劑(Fisher Scientific，美國)；甲酸和磷酸均為色譜級(jí)試劑；水為超純水。

1.2 方法

1.2.1對(duì)照品溶液的制備。精密稱取沒食子酸對(duì)照品適量，加50%甲醇溶液制成每1 ml含202 μg的溶液，即得。

1.2.2供試品溶液的制備。取本品粉末(過四號(hào)篩)5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理60 min后，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3色譜分析條件。色譜柱Dikma Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)，柱號(hào)99903；乙腈-0.2%磷酸(3∶97)為流動(dòng)相；流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，檢測器為DAD，波長為270 nm。

1.2.4方法學(xué)考察。

1.2.4.1系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。分別吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μl，在“1.2.3”色譜條件下，注入液相色譜儀進(jìn)行測定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.2.4.2線性關(guān)系的考察。將沒食子酸對(duì)照品貯備液用50%甲醇稀釋制成每1 ml含202、 101、50.5、25.25、12.625、6.312 5、3.156 25 μg的系列溶液，分別吸取10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以進(jìn)樣濃度X(μg/ml)為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.4.3檢測限和定量限的考察。將沒食子酸對(duì)照品逐步稀釋后進(jìn)樣測定，以色譜圖中信噪比(S/N)為3時(shí)的進(jìn)樣量為最低檢測限(LOD)，信噪比(S/N)為10時(shí)的進(jìn)樣量為最低定量限(LOQ)。

1.2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試樣品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)色譜分析條件分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μl，測定峰面積積分值，計(jì)算RSD。

1.2.4.5精密度試驗(yàn)。取按“1.2.1”方法制備的對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積的RSD值。

1.2.4.6重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批號(hào)的樣品按“1.2.2”方法制備供試品溶液6份(樣品批號(hào)為白蘞02)，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜分析條件，進(jìn)樣量為10 μl，測定峰面積，計(jì)算平均含量和RSD。

1.2.4.7加樣回收試驗(yàn)。取同一批號(hào)已知含量的樣品6份(樣品批號(hào)為白蘞02)，精密加入分別與樣品中沒食子酸含量相等的對(duì)照品，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，再按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，進(jìn)樣量為10 μl，測定峰面積，計(jì)算平均回收率和RSD。

1.2.5樣品的含量測定。按“1.2.2”方法分別精密稱取10批不同產(chǎn)地的藥材粉末配制成供試品溶液各2份，按“1.2.4.2”方法對(duì)樣品進(jìn)行含量測定，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同產(chǎn)地白蘞藥材中沒食子酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。圖1表明，在“1.2.4.1”條件下，樣品譜圖中沒食子酸的保留時(shí)間為14 min左右，與其他化學(xué)成分能達(dá)到基線分離，其色譜峰與相鄰色譜峰分離度良好(與相鄰峰的分離度均大于1.5)，符合高效液相色譜定量分析的要求。理論塔板數(shù)以沒食子酸計(jì)為10 000以上。

2.1.2線性關(guān)系的考察。按“1.2.4.2”方法操作，峰面積分別為5 674.47、2 785.17、1 372.87、695.40、342.73、163.00、77.10，以進(jìn)樣濃度X(μg/ml)為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，計(jì)算得線性回歸方程為Y=28.103X-22.027(R2=0.999 9)，表明沒食子酸在3.15～202 μg/ml的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3檢測限和定量限的考察。按“1.2.4.3”方法操作，結(jié)果表明，沒食子酸的檢測限和定量限分別為0.002 2和0.006 3 μg。

2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.4.4”方法操作，計(jì)算得出峰面積積分值的RSD為0.80%，表明沒食子酸在24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.1.5精密度試驗(yàn)。按“1.2.4.5”方法操作，計(jì)算得峰面積的RSD為0.20%，表明在此試驗(yàn)條件下精密度良好。

2.1.6重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.4.6”方法操作，計(jì)算得平均含量為0.027%，RSD為2.30%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7加樣回收試驗(yàn)。由表1可見，平均回收率為102.8%，RSD為1.15%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于白蘞藥材中沒食子酸的含量測定。

2.2 含量測定由表2可知，大部分產(chǎn)地的白蘞藥材中沒食子酸含量為0.02%～0.03%，而產(chǎn)自湖北的白蘞藥材(編號(hào)01)中的沒食子酸含量明顯比其他產(chǎn)地的高，為0.052 25%。

3 結(jié)論與討論

3.1 對(duì)照品純度檢查方法采用HPLC等度洗脫，采用DAD檢測器檢測，樣品在190～400 nm范圍內(nèi)，除樣品峰外均沒有檢測到其他峰，樣品峰峰面積百分比達(dá)100%；增加進(jìn)樣量達(dá)到樣品出現(xiàn)平頭峰時(shí)，仍然未檢測出其他色譜峰。樣品峰的峰純度分析報(bào)告顯示，峰純度達(dá)98%。對(duì)照品核磁共振圖譜顯示沒有其他雜質(zhì)信號(hào)。

3.2 色譜條件的選擇

3.2.1色 譜 柱 的 選 擇。該試驗(yàn)對(duì)以下3種型號(hào)的C18柱進(jìn)

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=2)

行考察：Grace Smart RP18(250×4.6 mm，5 μm)，柱號(hào)0170301737；Agilent C18(250×4.6 mm，5 μm)，柱號(hào)880975-902；Dikma Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)，柱號(hào)99903。結(jié)果表明三者均能較好地分離沒食子酸且峰形較好，出于成本考慮，選用Dikma Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)。

3.2.2柱溫的選擇?？疾炝瞬煌鶞?25、30、35 ℃)對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明柱溫對(duì)分離效果的影響不大，在合適的流動(dòng)相條件下，沒食子酸峰均能與其他峰達(dá)到基線分離，但考慮到其可操作性，在此選用30 ℃。

3.2.3流動(dòng)相的選擇。選擇了乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.2%磷酸2種流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行測定試驗(yàn)，結(jié)果表明，在2種流動(dòng)相系統(tǒng)條件下沒食子酸的分離效果差異不大，但乙腈-0.2%磷酸條件下峰形更好，因此最后選擇了乙腈- 0.2%磷酸(3∶97)作為流動(dòng)相，且每次分析結(jié)束時(shí)加強(qiáng)對(duì)色譜柱和液相系統(tǒng)的沖洗和維護(hù)。

3.2.4檢測波長的選擇。取沒食子酸對(duì)照品的甲醇溶液，用DAD全波長掃描，在220、273 nm波長處有最大吸收。該試驗(yàn)按照《中國藥典》2010年版一部附錄ⅤA[7]的有關(guān)規(guī)定，先檢查了所使用的乙腈溶劑在供試品測定所用波長附近是符合要求的，結(jié)合其他相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]，選擇270 nm為測定波長。

因此該試驗(yàn)采用了“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇

3.3.1提取方法的選擇。采用2種不同的提取方法(超聲、加熱回流)提取白蘞中的沒食子酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種方法提取的沒食子酸含量分別為0.173 4、0.169 1 mg/g，表明超聲法提取效果略優(yōu)于加熱回流提取法，操作簡單，故選用超聲法。

3.3.2提取溶劑的選擇。選用了不同溶劑(20%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、80%甲醇)進(jìn)行超聲提取，結(jié)果表明，沒食子酸含量分別為0.132 8、0.142 8、0.173 3、0.157 3、0.135 3 mg/g，表明用50%甲醇作為提取溶劑的提取效果略優(yōu)于其他溶劑，故選用50%甲醇作為提取溶劑。

3.3.3提取藥液比的選擇。選用不同提取藥液比(1∶10、1∶25、1∶50、1∶80、1∶100)進(jìn)行超聲提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒食子酸含量分別為0.229 0、0.159 8、0.151 9、0.158 4、0.148 0 mg/g，表明提取藥液比為1∶10時(shí)沒食子酸含量最高，提取效果最好，故采用提取藥液比為1∶10。

3.3.4提取時(shí)間的選擇。分別考察超聲時(shí)間(20、30、40、60、90 min)對(duì)沒食子酸的提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒食子酸含量分別為0.128 4、0.143 3、0.146 6、0.147 1、0.134 7 mg/g，表明超聲60 min時(shí)提取效果略優(yōu)于其他時(shí)間，故采用超聲提取60 min。

因此該試驗(yàn)采用了“1.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法。

3.4 小結(jié)根據(jù)10批不同產(chǎn)地樣品的測定結(jié)果，建議本品(按干燥品計(jì)算)含沒食子酸(C7H6O5)不得少于0.02%。采用HPLC法，以沒食子酸為指標(biāo)性成分，可有效地控制白蘞藥材的質(zhì)量，且該方法重復(fù)性好，操作簡便、靈敏、準(zhǔn)確，為進(jìn)一步制定白蘞藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

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Determination of Gallic Acid in Prepared Slices ofAmpelopsisjaponicaby RP-HPLC

LE Jia-mei1,2, XIONG Xiao-juan2, BI Bao-bao3, LU Wen-quan1*

(1.Changzheng Hospital， Second Military Medical University, Shanghai 200003; 2. College of Chemical and Biological Engineering, Yichun University, Yichun, Jiangxi 336000; 3. School of Chemistry and Chemical Engineering, Henan University, Kaifeng, Henan 475000)

[Objective] To establish an RP-HPLC method for determination of gallic acid inAmpelopsisjaponica. [Method] The analysis was carried out on an Dikma Diamonsil C18column(250×4.6 mm, 5 μm)and the mobile phase was acetonitrile -0.2%phosophorie acid (3∶97) at the flow rate of 1.0 ml/min; the detection wavelength was 270 nm and the column temperature was 30 ℃. [Result] The linear range for gallic acid was 3.15-202 μg/ml (R2= 0.999 9 ). The average recovery was 102.8% (RSD= 1.15% ). [Conclusion] This method is simple, rapid, accurate, and it can be used for the quality control of the prepared slices ofAmpelopsisjaponica.

Ampelopsisjaponica; Gallic acid; RP-HPLC; Quality control

2015版中國藥典項(xiàng)目“白蘞藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究”。

樂佳美(1990- )，女，江西撫州人，碩士研究生，研究方向：天然藥物活性成分與中藥質(zhì)量控制研究。*通訊作者，副主任藥師，博士，碩士生導(dǎo)師，從事醫(yī)院藥學(xué)研究。

2014-12-15

S 567

A

0517-6611(2015)04-108-03