王艷敏，張妍妍，白 卉

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所速生林木培育重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150081；2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150081)

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小黑楊PnsICE1基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

王艷敏1，2，張妍妍1*，白 卉1*

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所速生林木培育重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150081；2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150081)

[目的]構(gòu)建PnsICE1基因的植物表達(dá)載體，并進(jìn)行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化，以期為進(jìn)一步研究小黑楊PnsICE1基因功能提供材料。[方法]以pROKⅡ載體為骨架，利用In-Fusion連接方法構(gòu)建由CaMV35S調(diào)控的小黑楊PnsICE1基因植物表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。[結(jié)果]通過PCR檢測，結(jié)果證明PnsICE1基因已整合到擬南芥基因組中，獲得3株轉(zhuǎn)PnsICE1基因擬南芥。[結(jié)論]植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的獲得為研究小黑楊PnsICE1基因功能提供材料。

小黑楊；PnsICE1；遺傳轉(zhuǎn)化

低溫傷害是世界上普遍存在的問題，也是造成農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)損失巨大的一種嚴(yán)重自然災(zāi)害[1]。研究并提高植物耐寒能力具有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，導(dǎo)入外源基因提高植物抗逆性已成為現(xiàn)代植物育種的主要手段。ICE1(inducer of CBF expression1)也被稱為誘導(dǎo)CBF表達(dá)基因，是能夠調(diào)節(jié)冷誘導(dǎo)基因(cold-regulated，COR)表達(dá)的最上游轉(zhuǎn)錄因子。它編碼一個類似轉(zhuǎn)錄激活基因(MYC)的bHLH 轉(zhuǎn)錄因子，在常溫下鈍化，在低溫下能夠特異地結(jié)合CBF3啟動子中的MYC作用元件，誘導(dǎo)CBF3的表達(dá)，CBF3進(jìn)一步結(jié)合到其下游目的基因啟動子的DRE序列，誘導(dǎo)下游一系列冷誘導(dǎo)基因以及其他在植物寒冷適應(yīng)中起作用基因的表達(dá)，繼而提高轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性[2-4]?，F(xiàn)已知轉(zhuǎn)ICE1基因的擬南芥、柑橘、甜楊、蘋果、大花蕙蘭、水稻、煙草與非轉(zhuǎn)基因植株相比，抗寒性都得到了提高[5-18]。筆者利用In-Fusion連接方法構(gòu)建小黑楊PnsICE1基因植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥，為進(jìn)一步研究小黑楊PnsICE1基因功能提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料哥倫比亞野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)：生態(tài)型Columbia(Col-0)，種植于人工土(黑土∶蛭石∶珍珠巖= 3∶2∶1)中。

菌株與載體：大腸桿菌感受態(tài)(Esherichiacoli)Top10 購自北京原平皓生物技術(shù)有限公司。根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105由黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所速生林木培育重點驗室保存。pROKⅡ Vector 由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈。

高效連接試劑盒In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit、T4DNA連接酶、TaqDNA 聚合酶、dNTP Mixture、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000均購自TaKaRa公司。

限制性內(nèi)切酶均購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司公司(Promega, http://www.promega.com/)。

抗生素：利福平(Rifampicin，Rif)、羧芐青霉素(Carbenicillin, Cab)、乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)購自北京國藥化學(xué)試劑有限公司(http://www.crc-bj.com/)，卡那霉素(Kanamycin，Kan)和氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)購自Sigma公司。

所用引物及測序委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成及完成(Sangon，http://www.sangon.biogo.net/)，引物序列：PnsICE1-OE F：5′-TCGAGCTCGGTACCCATGCTTTATAGACTCAATAGC-3′；PnsICE1-OE R：5′-CTCTAGAGGATCCCCCTACATCGCGCCATGGAAGCC-3′；pROKⅡ F：5′-GGCGAACGTGGCGAGAAAGG-3′；pROKⅡ R：5′-ACAGGTT-TCCCGACTGGAAAGC-3′。

1.2 PnsICE1基因植物表達(dá)載體構(gòu)建以之前獲得的陽性克隆pMD18-T-PnsICE1質(zhì)粒為模板，PnsICE1-OE F和PnsICE1-OE R為引物(下劃線為引入pROKⅡ同源互補(bǔ)序列)，利用PCR方法引入pROKⅡ質(zhì)粒線性化末端的同源互補(bǔ)序列。PCR 擴(kuò)增體系：DNA 2.0 μl，10×ExTaqPCR buffer2.0 μl，10 mmol/L dNTP Mix 0.4 μl，10 μmol/L引物各1.0 μl，5 U/μl ExTaq0.2 μl，補(bǔ)水至20.0 μl。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性 10 s、58 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸2 min，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，以DL2000 DNA Marker 為參照?；厥誔CR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶SmaI對pROKⅡ vector進(jìn)行單酶切。將目的基因(PnsICE1)片段與pROKⅡ vector的連接反應(yīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽性克隆PCR檢測。挑取陽性克隆送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將測序成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，進(jìn)行農(nóng)桿菌菌液檢測。

1.3 浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥采用蘸花法進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化[14]，將盛花期的擬南芥的花序浸泡在含有過表達(dá)質(zhì)粒農(nóng)桿菌的浸染液中[3%蔗糖、150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液體培養(yǎng)基(pH5.8)，OD600≈ 0.2]10 s，期間輕輕搖動，取出后室溫放置10 min，再侵染一次。侵染過的植株需保濕，48 h后用水噴霧將轉(zhuǎn)化植株徹底清洗一次。21～28 d收集種子，加入適量變色硅膠保持干燥。標(biāo)記為T0代，4 ℃保存。轉(zhuǎn)基因擬南芥的T0代種子表面消毒后鋪于含50mg/L Kan的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行逐代篩選，直至獲得T3代種子，利用pROKⅡ載體引物對篩選出的抗性苗進(jìn)行PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PnsICE1基因植物表達(dá)載體構(gòu)建以之前獲得的陽性克隆pMD18-T-PnsICE1質(zhì)粒為模板，PnsICE1-OE F和PnsICE1-OE R為引物，利用PCR的方法引入pROKⅡ質(zhì)粒線性化末端的同源互補(bǔ)序列(圖1A)。提取pROKⅡ質(zhì)粒(圖1B)，用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ 對pROKⅡ vector進(jìn)行單酶切(圖1C)利用In-Fusion連接方法將質(zhì)粒與目的片段相連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，挑取3個單克隆進(jìn)行初步的菌液PCR檢測，獲得一個陽性轉(zhuǎn)化子，目的條帶為1 600 bp左右(圖1D)，將通過菌落PCR驗證目的片段正確的一個單克隆送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，經(jīng)序列比對成功后，提取陽性質(zhì)粒。將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，挑取5個單克隆將農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示均為陽性轉(zhuǎn)化子(圖1E)，保存菌種，用于下一步的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化。

2.2 PnsICE1基因過表達(dá)植物的鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥的T0代種子表面消毒后鋪于含50 mg/L Kan的篩選培養(yǎng)基上(圖2A),進(jìn)行逐代篩選，直至獲得T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥(圖2B)，利用pROKⅡ載體引物對篩選出的抗性苗進(jìn)行PCR檢測(圖3)，獲得的3株轉(zhuǎn)基因擬南芥均獲得與陽性對照相同目的條帶，而野生型對照植株未檢測到目的條帶，初步說明PnsICE1基因已整合到擬南芥基因組中。

3 討論

構(gòu)建林木重要基因植物表達(dá)載體并獲得過表達(dá)植株繼而研究其功能，對于闡明多年生木本植物抗寒調(diào)控的分子機(jī)制具有重要的理論意義。研究表明，植物ICEI轉(zhuǎn)錄因子在常溫下鈍化，在低溫下能夠特異地結(jié)合CBF3啟動子中的MYC作用元件，誘導(dǎo)CBF3的表達(dá)，CBF3進(jìn)一步結(jié)合到其下游目的基因啟動子的DRE序列，從而誘導(dǎo)下游一系列冷誘導(dǎo)基因以及其他在植物寒冷適應(yīng)中起作用的基因的表達(dá)，繼而提高轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性[2-4]。該研究將之前從小黑楊中獲得的pnSICE1基因利用In-Fusion連接方法成功構(gòu)建植物過表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥，成功獲得3株T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥，為進(jìn)一步研究小黑楊PnsICE1基因功能、PnsICE1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制提供材料。

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Construction of Plant Expression Vector ofPnsICE1 Gene inPopulussimonii×P.nigraand Transformation

WANG Yan-min1,2, ZHANG Yan-yan1*, BAI Hui1*

(1. Key Laboratory of Fast Growing Forest Cultivation, Forestry Science Research Institute of Heilongjiang Province, Harbin, Heilongjiang 150081; 2. Heilongjiang Forestry Academy of Science, Harbin, Heilongjiang 150081)

[Objective] The goal of this study was to structure the plant expression vector ofPnsICE1 and genetic transformation inArabidopsisthaliana, in order to provide the data of further study onPnsICE1. [Method] Based on the pROKⅡ vector, the plant expression vector ofPnsICE1 was constructed by the in-fusion method of attachment, in the vector,PnsICE1 gene was driven by promoterCaMV35S.PnsICE1 gene was transformed intoArabidopsisthalianavia Agrobacterium-mediated method. [Result] PCR detection indicated that the PnsICE1 was successfully integrated intoArabidopsisthalianagenome. [Conclusion] Construction of plant expression vector and acquisition of the transgenic plant in this study might be useful on study ofPnsICE1 gene function.

Populussimonii×P.nigra;PnsICE1; Transformation

黑龍江省省屬科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項“小黑楊抗寒轉(zhuǎn)錄因子ICE1基因及啟動子的克隆與功能分析”；黑龍江省科研機(jī)構(gòu)創(chuàng)新能力提升專項計劃項目(YC2014D005)；黑龍江省森工總局青年基金項目(sgzjQ2014007)；黑龍江省林業(yè)科學(xué)院青年基金項目(201411)。

王艷敏(1981-)，女，吉林鎮(zhèn)賚人，助理研究員，博士，從事林木遺傳育種工作。*通訊作者，張妍妍，助理研究員，從事森林培育工作。*通訊作者，白卉，副研究員，從事林木遺傳育種工作。

2014-12-12

S 181.3;Q 782

A

0517-6611(2015)04-047-03