李 凡，薛春梅，趙 曄，張躍華，李佳琳，杜春梅，趙永勛*

(1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.北京碧水源膜科技股份有限公司，北京 101407)

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四種香蘑屬真菌子實體抗氧化活性比較分析

李 凡1，薛春梅1，趙 曄2，張躍華1，李佳琳1，杜春梅1，趙永勛1*

(1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.北京碧水源膜科技股份有限公司，北京 101407)

[目的] 為了評價4種香蘑屬真菌的抗氧化活性。[方法] 對4種香蘑屬真菌子實體微波水提物進(jìn)行抗氧化活性比較分析。[結(jié)果] 灰褐香蘑(Lepistaluscina)、白香蘑(Lepistacaespitosa)、紫丁香蘑(Lepistanuda)、花臉香蘑(Lepistasordida)4種香蘑子實體提取物對二苯基苦味?；诫伦杂苫?·DPPH)和羥自由基(·OH)的清除作用較顯著，對·DPPH的清除率依次達(dá)到73.9%、59.2%、80.7%和82.8%；對·OH的清除率分別達(dá)到92.5%、95.7%、83.6%和94.4%。這4種真菌子實體提取物對超氧陰離子亦有一定的清除作用。[結(jié)論]4種香蘑真菌子實體中可能存在著活性較強的天然抗氧化活性物質(zhì)。

香蘑屬真菌; 抗氧化活性; DPPH; 羥自由基; 超氧陰離子

現(xiàn)代研究表明，許多疾病如心腦血管疾病、癌癥以及人體衰老等過程都與自由基過剩有關(guān)[1]。自由基是生物體內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)的普遍介質(zhì)，是帶有不配對電子的原子、原子團(tuán)或分子如羥自由基、超氧陰離子自由基等，可直接損傷各種生物膜，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[2]。因而，如何開發(fā)利用抗氧化活性物質(zhì)調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝、延緩衰老、預(yù)防疾病等問題已引起人們的廣泛關(guān)注。國內(nèi)外的許多研究證明，很多大型真菌子實體和發(fā)酵產(chǎn)物中多含有抗氧化活性物質(zhì)[3-6]。這表明大型真菌可能是提取天然、安全的抗氧化活性物質(zhì)的理想原料。

香蘑屬(Lepista)真菌隸屬于真菌門(Eumycota)擔(dān)子菌綱(Basidiomysetes)傘菌目(Agaricales)口蘑科(Tricholomatceae)。我國已發(fā)現(xiàn)有12種[7]。到目前為止，關(guān)于香蘑屬真菌子實體提取物抗氧化活性的比較研究未見報道。筆者主要通過制備灰褐香蘑[Lepistaluscina(Fr.) Sing.]、白香蘑[Lepistacaespitosa(Bres.)Sing.]、紫丁香蘑[Lepistanuda(Bull.:Fr.)Cooke]、花臉香蘑[Lepistasordida(Fr.)Sing]等4種常見香蘑子實體提取物，測定其清除·DPPH、·OH以及超氧陰離子的能力，評價這4種香蘑屬真菌的抗氧化活性，并且進(jìn)行比較分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料供試灰褐香蘑、白香蘑、紫丁香蘑、花臉香蘑均為野生香蘑，采集于黑龍江省佳木斯市周邊林場。

1.2 提取液的制備[8]將采集的白香蘑、灰褐香蘑、紫丁香蘑、花臉香蘑放入干燥箱中烘干，準(zhǔn)確稱取烘干后這4種香蘑各5.0 g，放入燒杯中，按料液比1∶20加雙蒸水至10.00 ml，用玻棒攪拌均勻，同時放入微波爐中，調(diào)至300 W輸出檔，定時1 min，取出，8 000 r/nmin離心4 min，取上清液，即為這4種香蘑的提取液。將這4種香蘑的提取液分別稀釋至0.5、1、2、4、6、8、10 mg/ml的濃度梯度，4 ℃冰箱保存，備用(保存時間最好不超過72 h)。

1.3 指標(biāo)測定與方法

1.3.1清除·DPPH能力的測定[9]。精確稱取DPPH試劑0.015 8 g,用無水乙醇溶解，并定容至200.0 ml，使其濃度為200 μmol/L,避光保存(該溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)用)。準(zhǔn)確吸取各濃度樣品溶液2.0 ml與2.0 ml DPPH溶液,加入同一具塞試管中，充分混勻，37 ℃恒溫水浴暗反應(yīng)30 min后，于波長517 nm處測定吸光度(Ai)，以無水乙醇調(diào)零。每個樣品平行測定3次，取平均值。按以下公式，計算各待測樣品對DPPH自由基的清除率。

式中，Ai為2.0ml樣品溶液與2.0mlDPPH試劑混合液的吸光度；Aj為2.0ml樣品溶液與2.0ml空白溶劑(無水乙醇)混合液的吸光度；Ao為2.0mlDPPH溶液與2.0ml溶劑混合液的吸光度。

1.3.2清除·OH能力的測定[10-12]。采取鄰二氮菲-Fe2+法測定羥基自由基的清除率。吸取 1.5 ml 5 mmol/L 鄰二氮菲應(yīng)用液，加入4 ml pH 7.4磷酸鈉緩沖液，再加入1.0 ml 7.5 mmol/L FeSO4溶液，立即混勻。加入1 ml某一濃度的樣品溶液，立即混勻。加入 1.5 ml雙蒸水以補充體積，最后加入1.0 ml濃度1% H2O2溶液，以雙蒸水代替H2O2溶液作為空白對照，輕輕混勻。37 ℃保溫 90 min，于 536 nm測定吸光度。

·OH清除率計算公式為：

式中，Ai為加入樣品(子實體提取液)及H2O2；Aj為加H2O2而不加樣品；As為兩者都不加；Ao為空白對照。

1.3.3清除超氧陰離子(·O2-)能力的測定[10-12]。取pH為8.2的Tris-HCl緩沖液6.0 ml，加入不同濃度的樣品0.5 ml，37 ℃水浴 10 min，最后加入 37 ℃預(yù)熱過的7 mmol/L PR(鄰苯三酚鹽酸溶液 )1.0 ml，混勻后反應(yīng)4 min，用0.5 ml濃鹽酸終止反應(yīng)，測定325 nm處吸光度(A)以等體積pH為8.2的Tris-HCl緩沖液為空白吸光度(A0)。蒸餾水調(diào)零。

式中，A(試樣)為試樣組在波長325nm的吸光度；A0為空白組在波長325nm的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 ·DPPH清除率的比較對這4種香蘑屬真菌子實體的水提物清除·DPPH的能力進(jìn)行雙因素方差分析。從圖1可以看出，這4種香蘑屬真菌子實體的水提物都有一定清除·DPPH的能力。在一定程度上，隨著子實體提取物濃度的增加，清除·DPPH的能力也在升高。當(dāng)質(zhì)量濃度為4.00 mg/ml時，灰褐香蘑、白香蘑、紫丁香蘑和花臉香蘑的·DPPH清除率均達(dá)到較大值，分別為70.5%、58.6%、80.4%和80.5%。·DPPH去除能力強弱順序為花臉香蘑>紫丁香蘑>灰褐香蘑 >白香蘑。在0.50～4.00 mg/ml濃度梯度范圍內(nèi)，·DPPH清除率隨著濃度的升高而增加。當(dāng)質(zhì)量濃度為6.00 mg/ml時，花臉香蘑的清除率最大，達(dá)到82.7%。在6.00～10.00 mg/ml濃度梯度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，4種香蘑的·DPPH清除率均有些許的降低。在0.50～10.00 mg/ml濃度梯度范圍內(nèi)，同種香蘑不同濃度梯度·DPPH清除率均有顯著差異。在提取物濃度相同的情況下，不同香蘑清除·DPPH能力之間存在差異，但白香蘑均與其他3種香蘑之間有顯著性差異。

2.2 清除·OH能力的比較從圖2可以看出，4種香蘑屬真菌子實體均有很強的清除·OH能力，在0.50～10.00 mg/ml濃度梯度范圍內(nèi)對·OH的清除能力均隨提取物質(zhì)量濃度的增加而升高。當(dāng)質(zhì)量濃度為4.00 mg/ml時，去除能力強弱順序為花臉香蘑>白香蘑>灰褐香蘑>紫丁香蘑。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/ml時，白香蘑的清除率最大，達(dá)到94.9%。在提取物濃度相同的情況下，不同香蘑·OH的能力均存在差異，但白香蘑均與其他3種香蘑之間的清除率均有顯著差異。

2.3 清除超氧陰離子能力的比較由圖3可知，4種香蘑屬真菌子實體對鄰苯三酚自氧化均有抑制作用，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對超氧陰離子的清除能力均隨提取物質(zhì)量濃度的增加而升高。在所測樣品中，白香蘑具有較強的清除超氧陰離子的能力，并且隨著濃度的升高而增加。當(dāng)質(zhì)量濃度為4.00 mg/ml時，清除超氧陰離子能力的強弱順序為花臉香蘑>白香蘑>灰褐香蘑>紫丁香蘑。而當(dāng)質(zhì)量濃度為10.00 mg/ml時，白香蘑的清除率最高，達(dá)到25.4%。在0.50～4.00 mg/ml濃度梯度范圍內(nèi)，各香蘑屬真菌間的清除率無顯著差異，但隨著質(zhì)量濃度的升高，紫丁香蘑與其他3種香蘑的清除率均有顯著性差異。這可能與紫丁香蘑的藥用成分有關(guān)。

3 討論

目前，食品安全成為全世界關(guān)注的話題。人工合成抗氧化劑存在潛在的致癌作用，以天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑是食品行業(yè)的發(fā)展趨勢[13]。傳統(tǒng)食用菌因含有多種抗氧化成分，受到人們的青睞，而對于那些珍惜的野生食用菌，科學(xué)家對其進(jìn)行系統(tǒng)性抗氧化活性比較分析的研究較少。

研究表明，灰褐香蘑、白香蘑、紫丁香蘑、花臉香蘑4種香蘑屬真菌子實體微波處理水提取物對·DPPH和·OH的清除作用比較顯著，其中對·DPPH的清除率分別達(dá)到73.0%、58.6%、80.0%和82.7%，花臉香蘑的清除能力最強；對·OH 的清除率分別達(dá)到91.0%、94.8%、82.3和90.3%，白香蘑的清除能力最強。4種香蘑屬真菌子實體的水提物對超氧陰離子均有一定的清除作用，分別達(dá)到17.3%、25.4%、14.8和17.5%，白香蘑的清除能力最強。這4種香蘑真菌子實體中可能存在著活性較強的天然抗氧化活性物質(zhì)，推測其水提物中含有較多親水性抗氧化活性物質(zhì)。該研究沒有對這4種香蘑屬真菌子實體中的抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，所以不能確定抗氧化活性物質(zhì)的具體成分，有待于今后進(jìn)行深入研究。

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A Comparative Analysis on Antioxidant Activity for Four Kinds ofLepistaepiphyte

LI Fan1, XUE Chun-mei1, ZHAO Ye2, ZHAO Yong-xun1*et al

(1.College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007；2. Beijing Origin Water Membrane Technology Co. Ltd, Beijing 101407)

[Objective] The research aimed to evaluate the antioxidant activity of four kinds ofLepistaepiphyte. [Method] The comparative analysis for anti-oxidant activity of fungi microwave water extracts of the four fragrant mushroom fruiting bodies was carried out. [Result] Fungi microwave water extracts ofLepistaepiphyte,Lepistaluscina,Lepistacaespitosa,LepistanudaandLepistasordidashowed significant clearance ,which was 73.0%, 73.0%, 58.6% and 73.0% respectively to ·DPPH and 91.0%, 94.8%, 82.3% and 91.0% respectively to ·OH in the microwave processed water extract of their fruiting body. Moreover, the fruiting body extracts of the four kinds of fungus showed a clear effect on superoxide anion. [Conclusion] Fruiting body of four kinds ofLepistaepiphytemight contain natural antioxidant substances.

Lepistaepiphyte; Antioxidant activity; DPPH; Hydroxyl free radicals; Superoxide anion

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項目(12531696)。

李凡(1989-)，女，山東陽谷人，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)。*通訊作者，教授，碩士生導(dǎo)師，從事真菌生物化學(xué)方面的研究。

2014-12-15

S 646

A

0517-6611(2015)04-015-03