田菲菲，劉雅莉, 杜靈娟，權(quán)永輝

(1 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(西北農(nóng)林科技大學(xué))/農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ACO-RNAi載體對(duì)百合胚性愈傷的轉(zhuǎn)化

田菲菲1,2，劉雅莉1,2, 杜靈娟1,2，權(quán)永輝1,2

(1 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(西北農(nóng)林科技大學(xué))/農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 建立高效穩(wěn)定的百合遺傳轉(zhuǎn)化體系，以得到甁插壽命長、開花早的百合轉(zhuǎn)基因品種。【方法】 以O(shè)T百合“羅賓那”的胚性愈傷組織為供試材料，從共培養(yǎng)方式(固體或液體共培養(yǎng))、農(nóng)桿菌菌液濃度(OD600=0.4，0.6，0.8，1.0，1.2)、亞精胺濃度(0.5，1.0，1.5，2.0 μmol/L)以及超聲波處理(功率60 W，處理時(shí)間分別為0，1，2，3，4 min)等方面對(duì)百合遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化?！窘Y(jié)果】 液體共培養(yǎng)能提高穩(wěn)定表達(dá)率并減少褐化率，穩(wěn)定表達(dá)率為 13.00%，褐化率為55.00%；農(nóng)桿菌菌液濃度(OD600)在0.8時(shí)為最適侵染濃度，此時(shí)穩(wěn)定表達(dá)率為12.77%，褐化率為55.00%；侵染前向菌液中加入2.0 μmol/L亞精胺能提高轉(zhuǎn)化效率，穩(wěn)定表達(dá)率為88.30%；當(dāng)超聲波功率為60 W、處理時(shí)間為3 min時(shí)，百合胚性愈傷的瞬時(shí)表達(dá)率和穩(wěn)定表達(dá)率均最高，分別為88.90%和27.33%；潮霉素抗性植株經(jīng)GUS組織化學(xué)染色、目標(biāo)基因PCR檢測及Southern blot分析，證明目的基因已整合到百合基因組中。【結(jié)論】 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化能夠有效提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的百合胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化率。

百合；轉(zhuǎn)基因；農(nóng)桿菌；超聲波；亞精胺

百合(Liliumspp.)為單子葉植物亞綱百合科(Lilicaccae)百合屬(Lilium)多年生草本球根花卉[1]，其花朵碩大，色彩豐富，花姿清雅，觀賞價(jià)值高[2],被廣泛用于切花和盆栽生產(chǎn)[3]。百合花期長短及瓶插壽命是衡量其觀賞價(jià)值的一個(gè)重要指標(biāo)，因此加強(qiáng)百合分子育種，創(chuàng)造新的百合品種，可以帶來更高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。目前很多研究表明，百合為乙烯躍變型花卉，乙烯的合成和釋放會(huì)縮短百合花切花壽命[4]，而ACC氧化酶(ACO)是乙烯合成的關(guān)鍵限速酶。因此，通過RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)控制百合花期乙烯的生物合成，能有效延長花期和瓶插壽命，提高觀賞價(jià)值，該研究具有廣闊的應(yīng)用前景[5]。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是目前轉(zhuǎn)基因最常用的方法。百合為單子葉植物，并非農(nóng)桿菌的天然寄主[6]，雖可以實(shí)現(xiàn)侵染轉(zhuǎn)化[7-8]，但遺傳轉(zhuǎn)化效率低，這成為制約百合轉(zhuǎn)基因育種發(fā)展的主要因素。影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素很多，如菌種的選擇、菌液活性、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)方式、pH值[9]及外植體的類型和狀態(tài)等。并且農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是農(nóng)桿菌和外植體共同作用的復(fù)雜過程。植物組織處于代謝活躍的狀態(tài)，分裂狀態(tài)的細(xì)胞更易整合外源DNA，從而能提高外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和轉(zhuǎn)化效率[10]。根癌農(nóng)桿菌附著在植物細(xì)胞壁上并相互作用，是轉(zhuǎn)化的先決條件。超聲波處理能在外植體的表面產(chǎn)生微傷口，使外源基因進(jìn)入，從而能夠提高轉(zhuǎn)化效率。Trick等[11]首次將超聲波技術(shù)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化中，建立了超聲波輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)(SATT)。SATT在很多植物中已成功得到應(yīng)用，如大豆、麻類等，轉(zhuǎn)化效率明顯提高[12-13]。

本研究以百合胚性愈傷組織作為受體材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化，探討了共培養(yǎng)方式、菌液濃度、亞精胺及超聲波處理對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，以期為得到高效穩(wěn)定的百合遺傳轉(zhuǎn)化體系及開花早、甁插壽命長的百合轉(zhuǎn)基因品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 試驗(yàn)于2012-07-2013-09在農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試材料為OT百合“羅賓娜”(LiliumOriental×Tumpet ‘Robina’)胚性愈傷組織，保存在胚性愈傷組織保持培養(yǎng)基上(MS+1 mg/L 毒莠定+30 g/L蔗糖+3 g/L植物凝膠)。

1.1.2 菌株與載體 試驗(yàn)用菌株為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105，由農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。轉(zhuǎn)化所用的載體pCAMBIA1301-pAR-CAM-RNAi-ACO由該實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，此載體的構(gòu)成如圖1所示。

質(zhì)粒T-DNA區(qū)段上攜帶有β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)基因，由CaMV 35S啟動(dòng)子調(diào)控；CaMV 35S啟動(dòng)子調(diào)控的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Hyg)作為選擇標(biāo)記基因；目的基因?yàn)镃aMV 35S啟動(dòng)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，包含正義和反義的插入片段。

1.2 方 法

1.2.1 農(nóng)桿菌菌液的制備 取含植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液60 μL，加入到含有50 mg/L卡納和25 mg/L利福平的20 mL液體YEB培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)12～16 h。4 ℃、6 000 r/min離心10 min，棄上清液收集菌體沉淀，然后向菌體中加入25 mL重懸液(MS+30 g/L 蔗糖+10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸+100 μmol/L 乙酰丁香酮)，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h后加入重懸液調(diào)節(jié)菌液OD600為0.4，0.6，0.8，1.0和1.2備用。

1.2.2 轉(zhuǎn)化及侵染 在超凈工作臺(tái)上將胚性愈傷組織浸入制備好的農(nóng)桿菌菌液中，浸泡10 min，期間不斷輕輕振蕩使菌液與外植體充分接觸，然后將外植體轉(zhuǎn)移至無菌濾紙上，吸干多余菌液后移入共培養(yǎng)基(MS+30 g/L蔗糖+10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸+100 μmol/L乙酰丁香酮+3 g/L植物凝膠)中，(25±2) ℃黑暗條件下共培養(yǎng)3 d，之后將外植體轉(zhuǎn)移至含有500 mg/L頭孢霉素的滅菌水中浸泡10 min，無菌水沖洗3～5次，濾紙吸干多余液體后移入篩選培養(yǎng)基中，篩選培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 毒莠定+500 mg/L頭孢霉素+25 mg/L潮霉素+30 g/L 蔗糖+3 g/L植物凝膠，于(25±2) ℃、16 h/d 光照條件下培養(yǎng)，每15 d繼代1次。

1.3 轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

1.3.1 共培養(yǎng)方式對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響 按1.2.2中的轉(zhuǎn)化方法，將侵染過的外植體置于固體或液體共培養(yǎng)基中，固體共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+30 g/L蔗糖+10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸+100 μmol/L 乙酰丁香酮+3 g/L植物凝膠；液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基為 MS+30 g/L蔗糖+10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸+100 μmol/L 乙酰丁香酮。液體共培養(yǎng)時(shí)，在無菌培養(yǎng)皿中鋪2層無菌濾紙，吸取5 mL液體共培養(yǎng)基將濾紙浸潤。(25±2) ℃黑暗條件下共培養(yǎng)3 d。

1.3.2 農(nóng)桿菌菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響 向農(nóng)桿菌菌液中加入重懸液，使農(nóng)桿菌菌液濃度(以O(shè)D600表示)分別為0.4，0.6，0.8，1.0，1.2。將制備好的不同濃度的農(nóng)桿菌菌液振蕩侵染百合胚性愈傷10 min，然后轉(zhuǎn)移至液體共培養(yǎng)基上，(25±2) ℃黑暗條件下共培養(yǎng)3 d。

1.3.3 亞精胺對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響 農(nóng)桿菌與外植體侵染前，向農(nóng)桿菌菌液中分別加入0.5，1.0，1.5，2.0 μmol/L亞精胺，以不加亞精胺為對(duì)照，對(duì)外植體進(jìn)行侵染。

1.3.4 超聲波處理對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響 將外植體浸入到裝有50 mL農(nóng)桿菌菌液的三角瓶中，無菌封口膜封緊瓶口。將盛有外植體的三角瓶置于超聲波破碎儀中進(jìn)行超聲波處理，超聲波功率為60 W，處理時(shí)間分別為0，1，2，3，4 min。將超聲波處理后的外植體繼續(xù)在農(nóng)桿菌菌液中浸泡，直到每個(gè)處理外植體與菌液共同作用時(shí)間為10 min，將侵染后外植體置于無菌濾紙上吸干多余菌液，之后接種于液體共培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

以上每個(gè)處理均取外植體40～60個(gè)，每處理重復(fù)3次。每個(gè)處理共培養(yǎng)3 d后脫菌處理，隨機(jī)取部分外植體進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，統(tǒng)計(jì)瞬時(shí)表達(dá)率，統(tǒng)計(jì)篩選培養(yǎng)4個(gè)月后得到的潮霉素抗性苗數(shù)，計(jì)算穩(wěn)定表達(dá)率。

1.3.5 胚性愈傷組織篩選培養(yǎng)及植株再生 將脫菌處理的外植體置于篩選培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 毒莠定 +500 mg/L頭孢霉素+25 mg/L潮霉素+30 g/L蔗糖+3 g/L植物凝膠)上，(25±2) ℃、16 h/d光照條件下培養(yǎng)，每15 d繼代1次。2個(gè)月后將未褐化的胚性愈傷轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基(MS+500 g/L頭孢霉素+25 mg/L潮霉素+30 g/L蔗糖+3 g/L植物凝膠)中，于(25±2) ℃、16 h/d的光照條件下培養(yǎng)，每2周繼代1次，2個(gè)月后得到抗性再生植株。以不加入抗生素培養(yǎng)基得到的非轉(zhuǎn)基因再生植株為空白對(duì)照。

1.4 轉(zhuǎn)化植株的檢測

1.4.1GUS組織化學(xué)染色分析 隨機(jī)抽取10～20個(gè)以上各處理得到的外植體、篩選得到的抗性苗及空白對(duì)照組得到的未轉(zhuǎn)化再生植株的葉片、根等組織浸入到GUS染液中，37 ℃過夜培養(yǎng)。然后用體積分?jǐn)?shù)為10%，30%，50%，70%，90%的乙醇進(jìn)行梯度脫色，觀察并統(tǒng)計(jì)染色結(jié)果。

1.4.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測 用CTAB法[14]提取抗性植株及未轉(zhuǎn)化植株基因組DNA。對(duì)Hyg、GUS和ACO-PDK基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析。其正反向擴(kuò)增引物為：Hyg-F：5′-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3′，Hyg-R：5′-CGCAAGGAATCGGTCAATACAC-3′，擴(kuò)增片段為554 bp；GUS-F：5′-GCGTGGTGATGTGGAGTATTG-3′，GUS-R：5′-TCGGTGATGATAATCGGCTGAT-3′，擴(kuò)增片段為301 bp；ACO-PDK-F：5′-GCTGACCTTCGGTACCAAGGTT-3′；ACO-PDK-R:5′-GCTAATATAACAAAGCGCAAGATCTATCAA-3′，擴(kuò)增片段為364 bp。將質(zhì)粒pCAMBIA1301和非轉(zhuǎn)基因植株DNA分別作為陽性和陰性對(duì)照。反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqMasterMix 12.5 μL，F(xiàn)orward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，DNA 1 μL，RNase-Free Water 9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.4.3 轉(zhuǎn)基因植株的Southern bolt檢測 對(duì)GUS、Hyg和ACO-PDKPCR檢測的陽性植株進(jìn)行Southern blot檢測，以質(zhì)粒pCAMBIA1301-35S-RNAi-ACO為模板，用引物Hyg-F和Hyg-R的PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物制備探針(554 bp)。具體操作方法參照DIG High Prime DNA標(biāo)記及雜交檢測試劑盒說明書。進(jìn)行Southern blot檢測時(shí)，取60 ng基因組DNA，用HindⅢ酶切過夜，酶切體系為500 μL：HindⅢ 40 μL；10×M buffer 50 μL；DNA 60 ng；加ddH2O至500 μL。酶切后用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)變性、中和后用高鹽轉(zhuǎn)移法將膠上的樣品轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，進(jìn)行雜交、洗膜、顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

2.1.1 共培養(yǎng)方式對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響 共培養(yǎng)是菌液與外植體作用的關(guān)鍵步驟，液體共培養(yǎng)能增加共培養(yǎng)的濕度，不同的共培養(yǎng)方式對(duì)侵染效果有一定的影響。如表1所示，液體共培養(yǎng)能夠顯著提高百合胚性愈傷組織的瞬時(shí)表達(dá)率(53.30%)，并且篩選培養(yǎng)2個(gè)月后，褐化率較低，為55.00%，穩(wěn)定表達(dá)率為13.00%；而固體共培養(yǎng)方式下，瞬時(shí)表達(dá)率為35.00%，褐化率較高為 76.70%，穩(wěn)定表達(dá)率僅為6.70%，可見液體共培養(yǎng)能提高百合轉(zhuǎn)化效率。這與2012年Wang等[15]報(bào)道的液體共培養(yǎng)能提高百合轉(zhuǎn)化率的研究結(jié)果一致。

2.1.2 農(nóng)桿菌菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響 在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，菌液濃度是影響轉(zhuǎn)化效率的一個(gè)重要因素，菌液濃度過低對(duì)外植體的侵染不夠充分，濃度過高則對(duì)外植體有毒害作用，因此農(nóng)桿菌菌液濃度過低或過高對(duì)轉(zhuǎn)化效率都有不良影響。表2顯示，當(dāng)農(nóng)桿菌菌液濃度(OD600)為0.4時(shí)，百合胚性愈傷組織瞬時(shí)表達(dá)率和穩(wěn)定表達(dá)率均較低，分別為8.87%和0.57%，并且褐化率也較高，為97.20%；之后隨著菌液濃度(OD600)的升高，瞬時(shí)表達(dá)率和穩(wěn)定表達(dá)率隨之升高，褐化率逐漸降低，當(dāng)菌液濃度(OD600)為0.8時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率和穩(wěn)定表達(dá)率均達(dá)到最高，分別為61.63%和12.77%，并且后期篩選過程中褐化率較低，為55.00%；隨著菌液濃度的繼續(xù)升高，瞬時(shí)表達(dá)率和穩(wěn)定表達(dá)率開始降低，褐化率升高，當(dāng)菌液濃度(OD600)升至1.2時(shí)，對(duì)外植體的毒害作用比較重，褐化率明顯提高，達(dá)到94.43%，并且穩(wěn)定表達(dá)率也較低，僅為1.13%。因此，確定最適農(nóng)桿菌菌液濃度(OD600)為0.8，這與張建鑫等[16]對(duì)百合的研究結(jié)果相吻合。

注：表中數(shù)據(jù)代表3次重復(fù)試驗(yàn)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”；同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母者表示在P≤0.05水平差異顯著。表3同。

Note:Data in the table are “average±standard error” of three repeat tests.Data in the same column with different lowercase letters have significant differences atP≤0.05 level.The same for Table 3.

2.1.3 亞精胺對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響 如圖2所示，向農(nóng)桿菌菌液中加入亞精胺能提高百合胚性愈傷組織的瞬時(shí)表達(dá)率，隨著亞精胺濃度的增加，瞬時(shí)表達(dá)率隨之升高，當(dāng)亞精胺濃度為2.0 μmol/L時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)到最高，為88.30%，而未加入亞精胺的對(duì)照瞬時(shí)表達(dá)率僅為53.30%；當(dāng)亞精胺濃度達(dá)到2.5 μmol/L時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率則明顯下降。據(jù)此可確定亞精胺的最佳濃度為2.0 μmol/L。

2.1.4 超聲波處理對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響 超聲波處理后對(duì)共培養(yǎng)3 d的外植體脫菌后進(jìn)行GUS染色，統(tǒng)計(jì)瞬時(shí)表達(dá)率和穩(wěn)定表達(dá)率，結(jié)果(表3)顯示，隨著超聲波處理時(shí)間的延長，瞬時(shí)表達(dá)率和穩(wěn)定表達(dá)率均隨之升高，在超聲波處理3 min后瞬時(shí)表達(dá)率及穩(wěn)定表達(dá)率均最高，分別為88.90%和27.33%，明顯比未經(jīng)超聲波處理的瞬時(shí)表達(dá)率及穩(wěn)定表達(dá)率高；而超聲波處理4 min后，瞬時(shí)表達(dá)率和穩(wěn)定表達(dá)

率均下降，這可能與超聲波處理時(shí)間過長造成的植物傷害不能恢復(fù)有關(guān)。

2.2 百合轉(zhuǎn)基因植株的檢測

2.2.1GUS組織化學(xué)染色 將篩選2個(gè)月后得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基(MS+500 mg/L頭孢霉素+25 mg/L潮霉素+30 g/L蔗糖+3 g/L植物凝膠)中，每2周繼代1次，2個(gè)月后得到再生植株。對(duì)未轉(zhuǎn)化的胚性愈傷組織及再生植株的根、葉和篩選得到的抗性苗的根、葉等進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果(圖3)顯示，轉(zhuǎn)化后篩選2個(gè)月的胚性愈傷組織及篩選得到的抗性苗的根和葉經(jīng)乙醇脫色后顯示藍(lán)色，而未轉(zhuǎn)化的胚性愈傷組織及再生植株的根、葉經(jīng)乙醇脫色后未顯示藍(lán)色。表明GUS基因在抗性愈傷組織及抗性苗的各個(gè)部位穩(wěn)定表達(dá)。

2.2.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測 本試驗(yàn)共得到344株轉(zhuǎn)基因苗，隨機(jī)抽取部分生長健壯的潮霉素抗性苗進(jìn)行PCR分析。分別對(duì)GUS、Hyg和ACO-PDK基因進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果從42株轉(zhuǎn)基因苗中擴(kuò)增得到了分別為GUS基因(301 bp)、Hyg基因(554 bp)和ACO-PDK基因(364 bp)的目的條帶。證明外源基因已整合到植物基因組中(圖4)。

2.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的 Southern blot檢測 為進(jìn)一步驗(yàn)證目的基因是否整合到百合基因組中，對(duì)PCR檢測為陽性的42個(gè)株系進(jìn)行Southern blot檢測，結(jié)果(圖5)表明，有4株有雜交條帶，其中植株1、2、4、5有雜交條帶，且植株5有2條雜交帶，說明其為Hyg的2個(gè)拷貝；植株1、2、4為單一雜交帶，說明其為Hyg單拷貝，而未轉(zhuǎn)化植株和植株3未產(chǎn)生雜交信號(hào)，表明目的基因Hyg未轉(zhuǎn)化到植株的基因組中。

3 討 論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是農(nóng)桿菌和外植體共同作用的復(fù)雜過程。外植體的類型和狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化效率起著至關(guān)重要的作用。有研究表明，當(dāng)植物組織處于代謝活躍的狀態(tài)時(shí)，分裂狀態(tài)的細(xì)胞更易整合外源DNA，從而提高外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和轉(zhuǎn)化效率[10]。本試驗(yàn)選用百合胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體材料，其具有繁殖速度快、細(xì)胞繁殖量大、轉(zhuǎn)化效率高、嵌合體少、無性變異小的優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)際轉(zhuǎn)基因工作中易轉(zhuǎn)化成功的受體材料[17]。在實(shí)際的轉(zhuǎn)基因過程中，胚性愈傷組織作為受體使遺傳轉(zhuǎn)化更易成功[18]，如De Benedetti等[19]利用百合花梗和花托誘導(dǎo)的胚性愈傷成功轉(zhuǎn)入了RolA、RolB、RolC基因，使百合表型得以改變。

RNAi是通過反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA特異性地抑制靶基因，通過人為引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(正義RNA和反義RNA)，從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的[20]。徐強(qiáng)等[5]構(gòu)建了玉簪ACO hpRNAi載體，期望對(duì)玉簪進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，使ACO基因轉(zhuǎn)錄后沉默從而達(dá)到抑制乙烯生物合成的目的。金曉玲等[21]運(yùn)用RNAi技術(shù)，對(duì)郁金香進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，希望通過沉默內(nèi)源ACO基因以達(dá)到延長花期的目的。張建鑫等[16]將ACO反義基因?qū)霒|方百合“索邦”基因組中，期望控制百合花期乙烯的生成，并獲得轉(zhuǎn)基因苗。

目前，人們普遍認(rèn)為在轉(zhuǎn)化過程中對(duì)植物組織進(jìn)行造傷處理能夠提高轉(zhuǎn)化效率。超聲波處理可使植物組織在超聲波機(jī)械能的作用下產(chǎn)生空化作用，使植物組織表面形成小氣泡，小氣泡破裂會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成微小創(chuàng)傷[22]，從而使細(xì)菌細(xì)胞侵入植物組織細(xì)胞中，以達(dá)到提高轉(zhuǎn)化效率的目的。目前該方法已在玉米[23]等植物的遺傳轉(zhuǎn)化中得到應(yīng)用。而超聲波功率高低、處理時(shí)間長短都是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。超聲波功率過高、處理時(shí)間過長時(shí)，對(duì)外植體的創(chuàng)傷大，使外植體不能恢復(fù)繼而在后續(xù)的篩選中褐化死亡；超聲波功率過低、處理時(shí)間短，則對(duì)外植體的造傷不夠，外源基因不能順利進(jìn)入外植體，這也是在篩選過程中外植體褐化死亡的主要原因。因此，選擇適宜的超聲波功率及其處理時(shí)間很有必要。

多胺是植物細(xì)胞內(nèi)維持pH的酯族陽離子，它參與植物細(xì)胞分裂、體細(xì)胞胚發(fā)生、根的形成、花芽分化、果實(shí)發(fā)育、次生代謝、衰老、生物和非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)、核糖體生物合成和細(xì)胞程序性死亡等過程[24-26]。同時(shí)，多胺還能影響根癌農(nóng)桿菌vir區(qū)基因的感應(yīng)[27]，能激活農(nóng)桿菌vir區(qū)的毒性，增加T-DNA轉(zhuǎn)移到植物組織中的概率。如Chong-Pérez等[28]報(bào)道，亞精胺能增強(qiáng)GUS在香蕉中的瞬時(shí)表達(dá)率。本試驗(yàn)就亞精胺對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的百合胚性愈傷組織的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行了初步探索，顯示當(dāng)亞精胺濃度為2.0 μmol/L時(shí)，其能顯著提高GUS瞬時(shí)表達(dá)率。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)以百合胚性愈傷組織為外植體，進(jìn)行超聲波處理，并對(duì)轉(zhuǎn)化過程中的一些條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，液體共培養(yǎng)能提高百合轉(zhuǎn)化效率，農(nóng)桿菌菌液濃度(OD600)為0.8時(shí)為其最適侵染濃度。本試驗(yàn)也就亞精胺對(duì)百合胚性愈傷組織瞬時(shí)表達(dá)率的影響進(jìn)行了初步探討，結(jié)果表明，侵染前向農(nóng)桿菌菌液中添加2.0 μmol/L亞精胺，能提高瞬時(shí)表達(dá)率。當(dāng)超聲波功率為60 W、處理時(shí)間3 min、采取液體共培養(yǎng)方式時(shí)，均能提高百合胚性愈傷組織瞬時(shí)表達(dá)率和穩(wěn)定表達(dá)率。GUS組織化學(xué)分析、PCR分析和Southern blot檢測結(jié)果表明，目的基因Hyg已整合到百合基因組中。本研究結(jié)果為百合的分子育種及百合優(yōu)良品種的選育奠定了基礎(chǔ)。

[1] 汪發(fā)瓚，唐 進(jìn)．中國植物志：百合科 [M].北京：科學(xué)出版社，1980:116-166．

Wang F Z,Tang J.Flora of China:Lilicaccae [M].Beijing:Science Press,1980:116-166.(in Chinese)

[2] Azadi P,Otang N V,Supaporn H,et al.Increased resistance to cucumber mosaic virus (CMV) inLiliumtransformed with a defective CMV replicase gene [J].Biotechnology Letters,2011,33(6):1249-1255.

[3] Tribulato A,Remotti P C,L?ffler H J M,et al.Somatic embryogenesis and plant regeneration inLiliumlongiflorumThunb [J].Plant Cell Reports,1997,17(2):113-118.

[4] Meulen-Muisers J J M,Oeveren J C.Preliminary examination of some factors causing variation in flower longevity ofLiliumcut flowers [J].Lily Yearbook of the North American Lily Society,1990，43:61-66.

[5] 徐 強(qiáng),王長春,胡海濤,等.玉簪 ACC 氧化酶基因 RNA干涉表達(dá)載體的構(gòu)建 [J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,20(1):19-23.

Xu Q，Wang C C，Hu H T,et al.Construction of RNAi expression vector targeting ACO gene inHostaplantaginea[J].Acta Agriculture Zhejiangensis,2008,20(1):19-23.(in Chinese)

[6] Potrykus I.Gene transfer to plants:Assessment and perspectives [J].Physiologia Plantarum,1990,79(1):125-134.

[7] Hoshi Y,Kondo M,Mori S,et al.Production of transgenic lily plants byAgrobacterium-mediated transformation [J].Plant Cell Reports,2004,22(6):359-364.

[8] Hoshi Y,Kondo M,Kobayashi H,et al.Agrobacterium-mediated transformation ofLiliumlongiflorum[J].Acta Hortic,2005,673:543-547.

[9] Jia W,Davies W J.Modification of leaf apoplastic pH in relation to stomatal sensitivity to root-sourced abscisic acid signals [J].Plant Physiology,2007,143(1):68-77.

[10] De Bondt A,Eggermont K,Druart P,et al.Agrobacterium-mediated transformation of apple (Malus×domesticaBorkh.):An assessment of factors affecting gene transfer efficiency during early transformation steps [J].Plant Cell Reports,1994,13(10):587-593.

[11] Trick H N,Finer J J.SAAT:sonication-assistedAgrobacterium-mediated transformation [J].Transgenic Research,1997,6(5):329-336.

[13] Trick H N,Finer J J.Sonication-assistedAgrobacterium-mediated transformation of soybean [Glycinemax(L.) Merrill] embryogenic suspension culture tissue [J].Plant Cell Reports,1998,17(6/7):482-488.

[14] Jefferson R A,Kavanagh T A,Bevan M W.GUS fusions:Beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants [J].The EMBO Journal,1987,6(13):3901.

[15] Wang Y,van Kronenburg B,Menzel T,et al.Regeneration andAgrobacterium-mediated transformation of multiple lily cultivars [J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture (PCTOC),2012,111(1):113-122.

[16] 張建鑫，劉雅莉，孟 芮，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的百合 ACO 反義基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究 [J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,17(6):158-163.

Zhang J X,Liu Y L,Meng R,et al.Research on genetic transformation of ACO antisense gene into lily mediated byAgrobacteriumtumefaciens[J].Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica,2008,17(6):158-163.(in Chinese)

[17] 王麗娜，廖卉榮，楊素麗，等．百合遺傳轉(zhuǎn)化體系研究進(jìn)展 [J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(1)：127-133．

Wang L N,Liao H R,Yang S L,et al.Research progress on genetic transformation system in lily [J].Guizhou Agricultural Sciences,2008,36(1):127-133.(in Chinese)

[18] 王 凱，車代弟，王金剛，等．百合遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立 [J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(5)：39-43．

Wang K,Che D D,Wang J G,et al.Establishment of genetic transformation system of lily [J].Journal of Northeast Agricultural University,2008,39(5):39-43.(in Chinese)

[19] Mercuri A,De Benedetti L,Bruna S,et al.Agrobacterium-Mediated transformation withRolgenes ofLiliumlongiflorumThunb [C]//ⅩⅪ International Eucarpia Symposium on Classical versus Molecular Breeding of Ornamentals-Part Ⅰ. [S.l.]:[s.n.].2003:129-136.

[20] Fire A,Xu S Q,Montgomery M K,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA inCaenorhabditiselegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811.

[21] 金曉玲,李冰華,蔣培余,等.郁金香ACC氧化酶基因 RNAi 表達(dá)載體的構(gòu)建 [J].湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),2008,31(4):91-94.

Jin X L,Li B H,Jiang P Y,et al.Construction of RNAi expression vector targeting ACC oxidase gene inTulipagesnerianaL. [J].Journal of Natural Science of Hunan Normal University,2008,31(4):91-94.(in Chinese)

[22] 葉興國,王新敏,王 軻,等.提高植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率輔助策略研究進(jìn)展 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45(15):3007-3019.

Ye X G,Wang X M,Wang K,et al.A Review of some assisted strategies for improving the efficiency ofAgrobacterium-mediated plant transformation [J].Scientia Agricultura Sinica,2012,45(15):3007-3019.(in Chinese)

[23] 權(quán)瑞黨,尚 梅,張舉仁.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米自交系愈傷組織轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化 [J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào),2003,29(3):245-250.

Quan R D,Shang M,Zhang J R.Optimization of transformation conditions in maize inbred line calli viaAgrobacteriumtumefaciens[J].Journal of Plant Physiology and Molecular Biology,2003,29(3):245-250.(in Chinese)

[24] Bais H P,Ravishankar G A.Role of polyamines in the ontogeny of plants and their biotechnological applications [J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2002,69(1):1-34.

[25] Kuehn G D,Phillips G C.Role of polyamines in apoptosis and other recent advances in plant polyamines [J].Critical Reviews in Plant Sciences,2005,24(2):123-130.

[26] Hussain S S,Ali M,Ahmad M,et al.Polyamines:Natural and engineered abiotic and biotic stress tolerance in plants [J].Biotechnology Advances,2011,29(3):300-311.

[27] Vinod Kumar S,Rajam M V.Polyamines enhanceAgrobacteriumtumefaciensvir gene induction and T-DNA transfer [J].Plant Science,2005,168(2):475-480.

[28] Chong-Pérez B, Reyes M,Rojas L,et al.Establishment of embryogenic cell suspension cultures andAgrobacterium-mediated transformation in banana cv.‘Dwarf Cavendish’(MusaAAA):Effect of spermidine on transformation efficiency [J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture (PCTOC),2012,111(1):79-90.

Genetic transformation of lily embryogenic callus with ACO-RNAi vector byAgrobacteriumtumefaciens

TIAN Fei-fei1,2,LIU Ya-li1,2,DU Ling-juan1,2,QUAN Yong-hui1,2

(1StateKeyLaboratoryofCropStressBiologyinAridAreas(NorthwestA&FUniversity)/KeyLaboratoryofHorticulturalPlantBiologyandGermplasmInnovationinNorthwestChina,MinistryofAgriculture,Yangling,Shaanxi712100,China; 2CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study aimed to establish an efficient and stable genetic transformation system of lily to obtain genetically modified lily varieties with long service life and early flowering.【Method】 Using embryogenic callus of OT lily “Robina” as material,the lily genetic transformation system was optimized based on co-culture methods (liquid or solid co-culture),bacterial concentrations (OD600=0.4,0.6,0.8,1.0,and 1.2),and spermidine concentrations(0.5,1.0,1.5,and 2.0 μmol/L),and different sonication treatments (60 W power by 0,1,2,3,and 4 min respectively ).【Result】 Liquid co-culture improved the transformation efficiency (13.00%) and reduce browning rate (55.00%).Bacterial concentration of OD600at 0.8 was the optimum concentration with transient expression rate and browning rate of 12.77% and 55.00%,respectively.Adding 2.0 μmol/L spermidine to bacteria before infection improved the transformation efficiency with stable transformation rate of 88.30%.When the sonication power was 60 W and the processing time was 3 min,the highest lily embryonic callus transient expression rate and stable expression rate of 88.90% and 27.33% were obtained,respectively.AfterGUShistochemical analysis,PCR detection and Southern blot analysis,it was confirmed that the target gene was successfully integrated into the lily genome of hygromycin resistant plants.【Conclusion】 Optimizing the transformation conditions can effectively improve theAgrobacterium-mediated genetic transformation rate.

lily;transgene;Agrobacteriumtumefaciens;sonication;spermidine

2013-10-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170652)

田菲菲(1987-)，女，陜西渭南人，在讀碩士，主要從事園林植物分子育種研究， E-mail:tianfei918@163.com

劉雅莉(1960-)，女，陜西西安人， 教授，碩士,碩士生導(dǎo)師，主要從事園林植物遺傳育種研究。 E-mail:lyl6151@126.com e Edition,2009,30(3):16-21.(in Chinese)

時(shí)間:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.006

S682.2+65

A

1671-9387(2015)03-0105-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.006.html