吳高殷，韋小麗，王 曉，梁 嫻

（貴州大學 a.林學院；b.貴州省森林資源與環(huán)境研究中心，貴州 貴陽 550025）

花櫚木Ormosia henryi為豆科紅豆屬常綠喬木，我國珍貴用材樹種，自然分布于我國安徽、浙江、江西、湖南、湖北、廣東、四川、貴州、云南9 個省份，海拔100～1 300 m。花櫚木因材質致密、紋理均勻，是制作高檔家具和工藝品的重要原材料，具有較高經(jīng)濟價值和極大開發(fā)潛力。目前，播種繁殖仍然是花櫚木繁育的主要方式，但因母樹稀少且結實有大小年現(xiàn)象，種子采集困難，且種子繁殖不利于母樹優(yōu)良性狀的保存。因此，開展花櫚木無性快繁技術研究，提高繁殖系數(shù)，是解決花櫚木種子來源不足、保持母樹優(yōu)良性狀的重要途徑。前人分別采用花櫚木種子[1]、莖段[2]和下胚軸[3]為外植體，通過器官發(fā)生途徑初步建立了再生體系，但再生體系獲得的植株數(shù)量較少，尚未能滿足其推廣運用。

體細胞胚胎發(fā)生技術是一種重要的植物體外再生方法[4]，可通過生物反應器進行大規(guī)模生產(chǎn)[4]，其具有繁殖速度快[6]、產(chǎn)量高[7]、利于種質資源保存[4]和遺傳轉化[6]等優(yōu)勢，較器官發(fā)生是一種更加高效的無性繁殖技術[4]。它是單個體細胞或植物組織經(jīng)脫分化、再分化形成再生植株的一個復雜生化過程[8]，其中，胚性愈傷是胚胎形成的前體和體胚發(fā)生的關鍵材料，胚性愈傷經(jīng)生長發(fā)育后可形成大量胚狀體，其生理和形態(tài)學類似于合子胚[9]，是研究胚胎起源、早期生理、分子和形態(tài)的理想模型材料[10-11]。

目前，針葉樹種如落葉松[12]、紅松[13]、輻射松[14]和云杉[15]等，其成熟的體胚發(fā)生再生體系已被建立，而闊葉樹種體胚發(fā)生體系僅在部分樹種中得以運用，如鵝掌楸[16]、龍眼[17]和咖啡[7]等。體細胞胚胎發(fā)生受諸多因素影響。其中外植體本身的狀況尤其是基因型和胚的成熟度是影響體胚發(fā)生的主要因素?；蛐褪求w胚發(fā)生的內在因子[9]，不同基因型對體細胞胚胎發(fā)生的敏感度不一樣[18-19]，未成熟胚的采種時期影響著體胚的誘導[15]。一些研究表明，不同基因型成熟胚和不同采種時期的未成熟胚在生理上存在一定差異，對體胚誘導具有顯著性影響[12]，但對其相關差異的機理研究甚少。

通過對花櫚木不同基因型成熟胚和不同采集期獲得的未成熟胚進行愈傷誘導實驗，以期篩選出花櫚木高頻體胚發(fā)生的基因型和采種時期，為花櫚木體胚誘導篩選適宜的繁殖材料。在實驗中測定不同基因型成熟胚和不同發(fā)育程度的未成熟胚誘導出的胚性愈傷組織的生化物質變化，并觀察胚性愈傷的起源方式，以揭示不同基因型和不同發(fā)育程度未成熟胚誘導胚性愈傷差異的生理生化基礎，探明花櫚木體胚發(fā)生前期組織形態(tài)學變化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

不同基因型的種子采集及處理：2017年11月從7 個種源地收集7 株花櫚木單株成熟種子，置于4 ℃冰箱中貯藏。7 株母樹基本情況及其種子表型特征見表1。實驗開始前，加2 滴吐溫-20，清洗花櫚木種子表面雜質，晾干后使用濃H2SO4處理1 h，回收濃H2SO4，在自來水下沖洗掉種子表面的濃H2SO4。

不同發(fā)育程度的未成熟胚采集及處理：于2018年8月10日（T1）、8月20日（T2）、8月30日（T3）、9月9日（T4）和9月19日（T5）5 個時期（表2）在貴陽市花溪區(qū)楊中村采集花櫚木未成熟種子（基因型為GZHX），每次采樣約200 粒，帶回實驗室去除豆莢，取出未成熟種子（圖1），加入2 滴吐溫-20，在自來水下沖洗半小時。

表1 7 株母樹種子的基本信息?Table 1 Seed information of seven mother trees

表2 不同采種時期對胚性愈傷組織生長及生理的影響Table 2 Effects of different seed collecting stages on growth and physiology of EC

圖1 基因型GZHX 胚性愈傷的誘導Fig.1 EC induction of GZHX genotypes

1.2 方 法

1.2.1 胚性愈傷誘導

將上述種子轉移至超凈工作臺上，75%酒精處理1 min，2% NaClO 處理8 min，無菌水沖洗5遍（其中成熟種子須在無菌水中吸脹24 h）。然后使用刀片、鑷子取出成熟胚和未成熟胚，接種至培養(yǎng)基中進行胚性愈傷誘導。胚性愈傷誘導培養(yǎng)基參考Wu 等[20]的配方，為：B5+6-BA(0.2 mg/L)+2,4-D(2.0 mg/L)+蔗糖（30 g/L）+結冷膠（2.5 g/L）+谷氨酰胺（500 mg/L）。pH 值5.9±0.1，采用121 ℃高溫滅菌20 min。每個處理5 次重復，每個重復接種30～50 個外植體，接種后進行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2 ℃。第25 天觀察愈傷形態(tài)特征和統(tǒng)計胚性愈傷的誘導率。

1.2.2 體胚誘導

7 個基因型和5 個采種時期的胚性愈傷組織轉移至體胚誘導培養(yǎng)基B5+KT(0.5 mg/L)+2,4-D(1.0 mg/L)中[20]，每個處理4 個重復，每次重復20～30 個胚性愈傷組織。培養(yǎng)4 周后統(tǒng)計體胚誘導率。

1.2.3 胚性愈傷的生長監(jiān)測

不同基因型胚性愈傷誘導過程中，監(jiān)測胚性愈傷組織的質量，其取樣時間參考王高[13]和范建芝[21]的方法，分別于成熟胚接種后7、11、15、19、23、27、30 和33 d 稱量胚性愈傷的質量，每次稱量4～7 個胚性愈傷組織。

1.2.4 胚性愈傷生理生化的測定

不同基因型成熟胚和GZHX 基因型5 個采集時期未成熟胚在胚性愈傷誘導25 d 后，分別收集其胚性愈傷組織，用蒸餾水清洗掉胚性愈傷組織上的培養(yǎng)基，放入10 mL 離心管，貯藏在-80 ℃冰箱。待樣品收集完成后，統(tǒng)一測定其可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量；可溶性糖和淀粉含量采用硫酸-蒽酮法進行測定[22]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法進行測定[22]，每個處理測定5 個重復。

1.2.5 組織細胞學觀察

GZHX 基因型愈傷組織經(jīng)繼代培養(yǎng)40 d 后，收集胚性愈傷和非胚性愈傷固定在FAA 固定液中24 h，經(jīng)乙醇系列脫水和二甲苯透明等，常規(guī)石蠟切片，番紅-固綠進行雙重染色，在萊卡DM-3000 顯微鏡下進行觀察和拍照。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 18.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和相關性分析，通過Turkey檢驗進行差異顯著分析。

2 結果與分析

2.1 不同基因型和不同采種時期胚性愈傷組織的誘導

通過觀察，成熟胚在培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，有部分胚開始膨大和萌發(fā)。在成熟胚四周形成少量愈傷組織，胚性愈傷組織為結節(jié)狀愈傷組織，在外觀形態(tài)上均呈乳白色或黃白色，結構致密（圖1）。胚性愈傷誘導率因基因型不同而異（圖2）?；蛐虶ZGL 胚性愈傷誘導率最高（41.07%），比AHQM 和AHXN 分別高13.06%和21.44%，但與GZHX、GZPT、ZJLQ和ZJYK差異不顯著（P＜0.05）。

圖2 7 個基因型對胚性愈傷誘導的影響Fig.2 Effects of seven genotypes on EC induction

未成熟胚在培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～12 d，大部分未成熟胚膨大，尚未萌發(fā)；在未成熟胚周圍誘導出的胚性愈傷與成熟胚誘導的胚性愈傷在質地上表現(xiàn)出相同的特征。胚性愈傷組織誘導率受采種時期影響較大，隨采種時期的推遲呈先升高后降低的趨勢（圖3），T4 胚性愈傷誘導率最大（37.49 %），比T1 高10.49%，與T2、T3 和T5 差異不顯著性（P＜0.05）。

圖3 5 個采種時期對胚性愈傷誘導的影響Fig.3 Effects of five seed collecting stages on EC induction

2.2 不同基因型和不同采種時期體胚誘導

胚性愈傷組織在體胚發(fā)生培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 d，在胚性愈傷組織表面可觀測到表面光滑、顆粒狀的球形胚（圖4），隨著進一步的培養(yǎng)，可觀察到體細胞胚的發(fā)育（圖4g）。7 個基因型體胚發(fā)生誘導率具有顯著性差異（圖5），基因型GZPT的體胚發(fā)生誘導率最高（18.4%），比基因型GZHX、GZGL、ZJLQ、ZJYK、ANQM 分別高8%、11%、9%、10%、17%，而基因型ANXN 卻觀察不到體胚發(fā)生。

續(xù)圖4Continuation of Fig.4

圖5 7 個基因型對體胚發(fā)生誘導的影響Fig.5 Effects of seven genotypes on SE induction

5 個采種時期體胚發(fā)生誘導率呈先升高后降低的趨勢（圖6）。T4 體胚發(fā)生誘導率最高（14.2%），與T1、T2、T3、T5 差異不顯著。

圖6 5 個采種時期對體胚發(fā)生誘導的影響Fig.6 Effects of five seed collecting stages on SE induction

2.3 胚性愈傷組織生長和生化物質

2.3.1 不同基因型花櫚木胚性愈傷組織生長和生化物質比較

7 個基因型胚性愈傷的重量增長隨時間的增加類似“S”形曲線（圖7）。其中，基因型GZPT、GZHX、ANQM 和AHXN 胚性愈傷組織的生長在15～20 d 之間斜率最大，表明生長速度最快；ZJLQ 和ZJYK 胚性愈傷生長速度在15～25 d之間最大；GZGL 胚性愈傷生長速度在18～25 d之間最大，但7 個基因型胚性愈傷的生長速度均在25～30 d 之間明顯變緩。這說明不同基因型胚性愈傷組織的生長速率之間存在差異，隨著生長時間的增加，胚性愈傷組織的生長速度均變緩，甚至停止生長。

圖7 7 個基因型胚性愈傷的生長曲線Fig.7 Growth curves of EC in seven genotypes

7 個基因型胚性愈傷組織可溶性蛋白、可溶性糖和淀粉含量差異顯著（P＜0.05）（圖8）?；蛐虶ZPT 胚性愈傷可溶性蛋白含量最高，比含量較低的基因型ZJLQ 和ZJYK 高約1.76 倍?；蛐蚙JLQ 胚性愈傷淀粉含量最高，比基因型GZHX、GZPT 和GZGL 分別高1.50、1.41 和1.56倍，但與AHQM、QHXN 和ZJYK 差異不顯著（P＜0.05）?；蛐虯HQM 胚性愈傷可溶性糖含量最高，而GZPT 含量最低。表明不同基因型胚性愈傷組織積累碳氮的能力不同。

圖8 7 個基因型胚性愈傷組織生化物質比較Fig.8 Comparison of biochemical substances of seven genotypes EC

2.3.2 不同采集時間花櫚木胚性愈傷組織生長和生化物質比較

培養(yǎng)25 d 后，5 個采種時期胚性愈傷組織的重量增長差異不顯著。但5 個采種時期未成熟胚誘導的胚性愈傷可溶性蛋白、淀粉、可溶性糖差異顯著（P＜0.05）（表2）。

T2 的胚性愈傷組織可溶性蛋白含量最大，是含量最低的T5 的1.41 倍。T1 誘導的胚性愈傷的可溶性糖和淀粉含量均最高。結果表明采種前期未成熟胚誘導出的胚性愈傷組織對碳氮積累能力較強且具有更高的生理活性。

2.4 相關性分析

對體胚發(fā)生誘導率與不同基因型種子特征和胚性愈傷生理特性的相關性分析，結果見表3。由表3得出，體胚誘導率與胚性愈傷誘導率呈極顯著正相關，與基因型呈極顯著負相關，與種子厚度的呈顯著相關，與其他參數(shù)不具有相關性。由此可見，花櫚木在不同基因型胚性愈傷組織的生長、生理特性及種子特征上雖然具有差異，但是它們的一些特性對體胚發(fā)生的相關性不大。這表明體胚發(fā)生誘導率是一個較為復雜的過程。

對體胚發(fā)生誘導率與不同采種時期種子特征和胚性愈傷生理特性的相關性分析，結果見表4。由表4得出，體胚發(fā)生誘導率僅與采種時期呈極顯著負相關，與其他因子不具有相關性，特別是與胚性愈傷組織誘導率不具有相關性，這與不同采種時期胚性愈傷組織誘導率差異不顯著有關。

2.5 愈傷組織結構及胚性愈傷的起源

觀察發(fā)現(xiàn)，花櫚木愈傷組織初期有兩種愈傷類型，一種為乳白色，塊狀和硬實的愈傷組織是非胚性愈傷組織；另一種為黃白色和緊密的愈傷組織是胚性愈傷組織。通過組織學觀察可見非胚性愈傷組織細胞較大、排列松散、空泡現(xiàn)象較多、染色淺、細胞質少、細胞核小甚至觀察不到（圖9a）；而胚性愈傷組織細胞小、排列緊密、空泡現(xiàn)象較少、細胞質濃厚、細胞核明顯的愈傷為胚性愈傷組織（圖9b）。胚性愈傷在組織內部和組織周圍均可觀察得到，一種是起源于組織內部的胚性愈傷組織，由多細胞組織構成，四周有多層排列致密的薄壁細胞（圖9c）；另一種是起源于組織外部的胚性愈傷，與母體組織相連（圖9d）。隨著愈傷組織的進一步發(fā)育，在愈傷組織的表面有球狀胚的分化（圖9f）。此外，愈傷組織在繼代過程中，在同一塊愈傷組織上能夠同時觀察到胚性愈傷和非胚性愈傷組織，胚性愈傷從非胚性愈傷上長出（圖9e）。

表3 體胚發(fā)生誘導率與不同基因型種子特征和胚性愈傷生理特性的相關性分析?Table 3 Correlation analysis of somatic embryogenesis induction rate with seed Characteristics of different genotypes and physiological characteristics of embryogenic callus

表4 體胚發(fā)生誘導率與不同采種時期種子特征和胚性愈傷生理特性的相關性分析Table 4 Correlation analysis of somatic embryogenesis induction rate with seed characteristics of collecting stages and physiological characteristics of embryogenic callus

3 討 論

基因型對體外繁殖是一個重要的因子，特別是對體胚發(fā)生誘導[23-24]。在一些樹種改良中，體胚發(fā)生這一生物技術的應用是依賴于樹種基因型的[25]。展示7 株母樹的種子除了在千粒重和表型上具有明顯差異外，其胚性愈傷組織誘導率和體胚誘導率也存在差異。其中，貴州和浙江種源地采集的成熟胚胚性愈傷誘導率均在35%以上，而安徽種源地成熟胚胚性愈傷誘導率卻均低于30%，基因型AHXN 尚未觀察到體胚。Fehér[26]和Sultan[27]認為不同基因型的差異與它們的環(huán)境有著錯綜復雜的關系，環(huán)境對植物的形態(tài)、功能和發(fā)育有顯著的影響；導致基因型在不同的條件下表現(xiàn)型是不同的[28]，且植物克隆能力的大小是自然選擇的結果，以應對外界不良環(huán)境使得后代得以繁衍。這些差異可能是造成體胚發(fā)生誘導率不同的原因。Hu 等[18]和Correia 等[23]報道可通過改變和優(yōu)化培養(yǎng)條件來減小不同基因型體胚發(fā)生誘導率之間的差異；此外，為了獲得更高頻體胚發(fā)生誘導率，還可擴大對基因型的篩選范圍。

胚性愈傷組織生理生化變化受外界因素影響較大。在花櫚木7 個基因型中，胚性愈傷可溶性蛋白含量在貴州種源（GZHX、GZPT 和GZGL）較 安 徽（ANQM 和ANXN) 和 浙 江（ZJLQ 和ZJYK）種源高，而胚性愈傷可溶性糖和淀粉含量在安徽和浙江種源卻高于貴州種源。這種生理上的差異可能是由于它們處于不同氣候和不同地域條件下引起差異基因表達，從而導致碳、氮代謝具有差異的原因。

圖9 細胞組織結構Fig.9 Histologial studies

7 個基因型成熟胚誘導出的胚性愈傷在培養(yǎng)基中生長速率呈先慢后快再慢的趨勢，生長曲線呈“S”形，這與范建芝[21]研究北美喬松中兩個細胞系愈傷生長曲線結果一致。北美喬松兩個細胞系愈傷生長速率最大值均在5～10 d 之間；紅松愈傷最大生長速率在12 d 左右，20 d 后增長趨于停滯[21]；而花櫚木不同基因型胚性愈傷組織最大生長速率的時間不同，但均在15～25 d 之間，表明花櫚木胚性愈傷生長速率比北美喬松和紅松慢。一般情況下，以外植體生長速率變緩為最佳繼代時間，北美喬松和紅松胚性愈傷最佳繼代時間為2～3 周，而花櫚木最佳繼代時間為25 d。

大量研究表明未成熟胚是體胚發(fā)生誘導較為理想的外植體，未成熟胚的成熟度顯著影響體胚發(fā)生響應。本實驗得出體胚發(fā)生誘導率隨未成熟胚采種時期的推遲呈先升高后降低的趨勢，T4 體胚誘導率達到最大值，這表明不同發(fā)育時期未成熟胚在相同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生不同的胚性反應。選擇適宜的采種時期可獲得更高體胚發(fā)生頻率，這在杉木[18]和輻射松[14]中有類似報道。Hu 等報道從卵裂多胚胎到明顯胚胎階段的未成熟合子胚胎對胚性愈傷組織的誘導反應最為敏感。未成熟胚體胚發(fā)生的響應可能與其生理狀況[29]和形態(tài)建成[30]有關。

花櫚木愈傷組織有兩種類型，一種是外植體誘導出的愈傷組織進入胚性途徑為胚性愈傷，而另一些細胞形成非胚性愈傷組織。兩種愈傷在外觀形態(tài)和組織結構上具有較大的差異。這兩種類型的愈傷組織是源于不同細胞類型還是細胞內外微環(huán)境觸發(fā)了不同形態(tài)發(fā)生？其原因尚未清楚。類似的研究在樹番茄[23]、冬青櫟[31]和杉木[18]等中均有發(fā)現(xiàn)。胚性愈傷經(jīng)生長發(fā)育后在形態(tài)學上類似于合子胚[9]，最終發(fā)育成與母本性狀一致的再生植株，而非胚性愈傷卻不能[32]。本試驗發(fā)現(xiàn)非胚性愈傷組織表面能夠觀察到黃白色、致密的胚性愈傷組織；這表明在適宜條件下，非胚性愈傷組織可以誘導出胚性愈傷組織。從花櫚木胚性愈傷的細胞結構觀察到胚性愈傷組織的起源方式即有內起源，又有外起源，這與項偉波[33]研究香榧胚性愈傷組織的起源方式一樣；崔凱榮等[34]認為體細胞胚胎發(fā)生起源方式可能與培養(yǎng)細胞在特定培養(yǎng)條件下是否是胚胎預決定細胞有關。盡管植物細胞可塑性強具有全能性的特點，但同種外植體在相同環(huán)境條件下卻具有不同的發(fā)育命運。雖然細胞預決定和細胞全能性可以部分解釋體胚發(fā)生起源機制，但細胞的起源仍然是現(xiàn)代生命科學中未解的最大謎團之一，要真正揭示植物細胞胚胎發(fā)生的起源機制還需要進一步的深入研究。而花櫚木胚性愈傷組織的內起源和外起源可為今后探索細胞起源的機理提供參考。

4 結 論

本研究表明花櫚木7 個基因型成熟胚和5 個采種時期未成熟胚對胚性愈傷誘導和體胚誘導具有顯著影響，且它們誘導出的胚性愈傷在生理生化上具有較大的差異；其中，胚性愈傷誘導率以基因型GZGL 和T4 最高；體胚發(fā)生誘導率以GZPT 和T4 最高。篩選出體胚高頻誘導率的基因型，并發(fā)現(xiàn)未成熟胚的采種時期對體胚誘導率有一個窗口期，這可為花櫚木體胚誘導篩選適宜的繁殖材料提供參考。