吳旭錦，朱小甫

(咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712000)

新城疫國(guó)標(biāo)RT-PCR診斷方法的優(yōu)化與應(yīng)用

吳旭錦，朱小甫

(咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712000)

【目的】 對(duì)新城疫(ND)國(guó)標(biāo)RT-PCR診斷方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，建立一種靈敏度高、特異性好、能直接從組織病料中進(jìn)行目的基因檢測(cè)的NDV套式RT-PCR(nest RT-PCR，RT-nPCR)方法。【方法】 根據(jù)GenBank上發(fā)表的新城疫病毒基因序列，設(shè)計(jì)并合成了2對(duì)引物，通過(guò)篩選最佳RT-nPCR條件，建立了NDV RT-nPCR檢測(cè)方法。通過(guò)靈敏性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)、病料檢測(cè)對(duì)比試驗(yàn)等，驗(yàn)證了RT-nPCR方法的可靠性和適用性?！窘Y(jié)果】 建立的NDV RT-nPCR方法靈敏度較高，檢測(cè)的極限為5.6×10-5ng/L；特異性較好，僅能從NDV中擴(kuò)增到目的條帶。從6份疑似組織病料中能直接檢測(cè)出4份陽(yáng)性結(jié)果，而國(guó)標(biāo)方法均未檢出，病毒分離鑒定結(jié)果與優(yōu)化后的RT-nPCR方法符合率達(dá)100%。【結(jié)論】 建立了一種靈敏度高、特異性好、可直接從組織病料中快速檢測(cè)NDV核酸的RT-nPCR方法。

新城疫；診斷方法；RT-PCR

新城疫(Newcastle disease，ND)是嚴(yán)重危害禽類的病毒性傳染病之一，是我國(guó)農(nóng)業(yè)部法定的一類動(dòng)物疫病[1]。ND的病原是新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)，屬副黏病毒科、腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)，有囊膜，具有能刺激宿主產(chǎn)生抑制紅細(xì)胞凝集素及病毒中和抗體的抗原成分[2]。病毒核酸類型為單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA。在NDV基因組上依次排列著NP、P、M、F、HN和L基因，分別編碼核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)和大分子蛋白(L)，其中F、HN蛋白與NDV的致病性密切相關(guān)[3-4]。

目前，雖然國(guó)內(nèi)養(yǎng)禽場(chǎng)對(duì)新城疫的預(yù)防極為重視，但新城疫的流行仍頻繁發(fā)生，損失巨大[5-6]。因此，及早診斷、盡快控制新城疫，對(duì)減少經(jīng)濟(jì)損失有重要意義。在我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T 16550-2008)中，診斷方法有臨床診斷、病毒分離鑒定、血凝-血凝抑制試驗(yàn)(HA-HI試驗(yàn))和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)等[7]。其中臨床診斷只能初步診斷，確診方法中的病毒分離鑒定、血凝-血凝抑制試驗(yàn)均需進(jìn)行病毒分離，耗時(shí)較長(zhǎng)，不適應(yīng)臨床快速診斷的要求。RT-PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，十分適合養(yǎng)殖場(chǎng)快速定性診斷的需要。但是，在筆者實(shí)際應(yīng)用國(guó)標(biāo)RT-PCR方法進(jìn)行診斷時(shí)發(fā)現(xiàn)，直接將采集的棉拭子、肺臟或脾臟等處理后提取RNA，然后進(jìn)行RT-PCR得到的卻是陰性結(jié)果，而通過(guò)雞胚接種傳1～3代后，用尿囊液提取RNA進(jìn)行RT-PCR得到的是陽(yáng)性結(jié)果，提示國(guó)標(biāo)方法的靈敏度不夠，樣品中病毒含量較低時(shí)可能無(wú)法有效擴(kuò)增。研究發(fā)現(xiàn)，套式PCR能夠大幅度提高基因擴(kuò)增的靈敏度，即使在模板濃度較低的情況下也能高效擴(kuò)增目的基因[8]。為此，本研究對(duì)診斷NDV的國(guó)標(biāo)RT-PCR進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)，提高其檢測(cè)靈敏度，以期在臨床中能夠直接從組織病料中有效擴(kuò)增目的片段，達(dá)到快速診斷的目的。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病 毒 新城疫病毒SXWN株由咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。參考毒株中，傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、雞痘病毒(POX)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)和禽腦脊髓炎病毒(AEV)均為商品疫苗毒株，禽流感H9亞型病毒(H9 AIV)由動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 病 料 本實(shí)驗(yàn)室采集或雞場(chǎng)送檢的組織病料包括發(fā)病雞肺臟、脾臟、氣管，分別來(lái)自陜西渭南、咸陽(yáng)和西安地區(qū)雞場(chǎng)，共計(jì)6份，研磨處理，12 000 r/min離心10 min，收集上清液并于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 雞 胚 SPF雞胚由陜西楊凌綠方生物工程有限公司提供。

1.1.4 試 劑 TRIzol Reagent、DNAzol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品，AMV反轉(zhuǎn)錄酶(10 U/μL)、RNA酶抑制劑(40 U/μL)、DEPC處理水、rTaq酶(5 U/μL)、dNTP(各成分均為10 mmol/L)等均購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司，NDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清和NDV標(biāo)準(zhǔn)抗原均為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品。

1.1.5 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GB/T 16550-2008，根據(jù)GenBank上發(fā)表的LaSota株(GenBank登錄號(hào)：JF950510)、Mukteswar株(GenBank登錄號(hào)：JF950509)、NDV08-004株(GenBank登錄號(hào)：FJ794269)的F基因序列，設(shè)計(jì)并合成了2對(duì)引物：NDV-F1.5′-CTCTACTAAGCTGGAGAA-3′(4327-4344，為相對(duì)于LaSota株基因組位置，以下同)，NDV-R1.5′-CTTGTTTAAAGCGGGA-3′(5239-5224)；NDV-F2.5′-ATGGGCYCCAGAYCTTCTAC-3′(4544-4563),NDV-R2.5′-CTGCCACTGCTAGTTGTGA-TAATCC-3′(5078-5054)。引物預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度535 bp，由生工生物工程(上海)有限公司合成，均用DEPC處理水稀釋到20 μmol/L。

1.2 方 法

1.2.1 NDV RNA的提取和第一鏈cDNA的合成 取NDV SXWN株尿囊液250 μL，按照TRIzol Reagent試劑說(shuō)明提取總RNA，空氣中自然干燥。在核酸干燥過(guò)程中，按照以下體系配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：DEPC處理水10.5 μL，上游引物NDV-F1 1.0 μL，dNTP 4.0 μL，5×AMV Buffer 4.0 μL，AMV 0.25 μL，RNA酶抑制劑 0.25 μL，總體積20.0 μL。核酸干燥后用配制好的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液充分溶解核酸，于42 ℃水浴中反轉(zhuǎn)錄90 min，取出后在核酸蛋白測(cè)定儀上測(cè)定cDNA的含量。

1.2.2 NDV RT-nPCR方法靈敏性試驗(yàn) 將cDNA溶液進(jìn)行10倍梯度稀釋至109倍，分別以各稀釋度cDNA溶液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第1次擴(kuò)增按照以下反應(yīng)體系進(jìn)行：cDNA 2.0 μL，超純水16.25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl22.0 μL，dNTP 1.0 μL，NDV-F1、NDV-R1各0.5 μL，rTaq酶0.25 μL，總體積25.0 μL。條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s，54 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃充分延伸10 min。取第1次擴(kuò)增產(chǎn)物2.0 μL作為模板進(jìn)行第2次擴(kuò)增，體系同第1次擴(kuò)增，引物為NDV-F2/NDV-R2。條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃充分延伸10 min。取5.0 μL第2次擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)照相并觀察。

1.2.3 NDV RT-nPCR方法特異性試驗(yàn) 提取NDV、IBV、IBDV、AEV和H9亞型AIV等RNA病毒的核酸并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；按照DNAzol Reagent試劑說(shuō)明提取POX和ILTV等DNA病毒的DNA模板，用NDV-F1/NDV-R1、NDV-F2/NDV-R2引物對(duì)分別進(jìn)行第1次和第2次PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并照相。

1.2.4 病料中NDV的檢測(cè)對(duì)比 用以上建立的檢測(cè)方法和國(guó)標(biāo)方法對(duì)收集的6份組織病料進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用SXWN株尿囊液作為對(duì)照。

1.2.5 病料中NDV的分離鑒定與RT-nPCR檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比 分別取6份組織病料上清液200 μL，接種于9日齡SPF雞胚尿囊腔，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，以后每隔6 h照蛋1次，收集死亡雞胚尿囊液。同樣方法連續(xù)傳代3次，收集第3代尿囊液用國(guó)標(biāo)HA-HI方法進(jìn)行病毒鑒定，鑒定后與建立的NDV RT-nPCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.6 盲傳3代雞胚尿囊液的國(guó)標(biāo)RT-PCR檢測(cè) 提取6份盲傳3代的尿囊液總RNA，用國(guó)標(biāo)RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NDV RT-nPCR檢測(cè)方法的靈敏性

經(jīng)過(guò)測(cè)定，SXWN株尿囊液RNA提取后反轉(zhuǎn)錄cDNA含量為560 ng/L，將其按照10倍梯度進(jìn)行稀釋，分別進(jìn)行nPCR。從圖1可知，所建立的方法能夠擴(kuò)增出107倍稀釋的cDNA，即檢測(cè)的極限為5.6×10-5ng/L。表明此方法靈敏度高，可以作為NDV檢測(cè)方法。

2.2 NDV RT-nPCR檢測(cè)方法的特異性

用所建立的方法對(duì)NDV、IBV、IBDV、POX、ILTV、AEV和H9亞型AIV陽(yáng)性毒cDNA/DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅有NDV擴(kuò)增出了535 bp的預(yù)期目的條帶，其他6種毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性(圖2)，提示所建立的方法特異性好。

圖2 NDVF基因RT-nPCR檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果
M.DNA Marker(100～1 000 bp)；1.NDV；2.IBV;3.IBDV;4.POX;5.ILTV;6.AEV;7.H9 AIV
Fig.2 Specialization test for NDV RT-nPCR

2.3 RT-nPCR與國(guó)標(biāo)RT-PCR方法對(duì)病料中NDV的檢測(cè)結(jié)果比較

提取收集的6份疑似感染NDV的組織病料總RNA，分別用建立的RT-nPCR方法與國(guó)標(biāo)RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用NDV SXWN株尿囊液進(jìn)行參照，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，RT-nPCR方法在6份組織病料中有4份擴(kuò)增出了目的條帶，參照的陽(yáng)性毒尿囊液同樣擴(kuò)增出了535 bp的條帶；而國(guó)標(biāo)RT-PCR方法對(duì)6份組織病料的擴(kuò)增均未出現(xiàn)目的條帶，僅有參照的陽(yáng)性毒尿囊液擴(kuò)增出了535 bp的條帶。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與國(guó)標(biāo)方法相比，本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法能夠從病料中有效擴(kuò)增目的條帶。

2.4 病料中NDV的分離鑒定與RT-nPCR檢測(cè)結(jié)果的比較

3次傳代后，用建立的RT-nPCR方法診斷的4份陽(yáng)性病料尿囊液HA效價(jià)達(dá)到28～210，而2份陰性病料尿囊液HA效價(jià)均為20，提示陰性病料中不存在具有血凝性的病毒。將4份有HA效價(jià)的尿囊液進(jìn)行HI試驗(yàn)，結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)NDV陽(yáng)性血清能有效抑制4份尿囊液的HA效價(jià)，提示分離到的確為NDV，與建立的RT-nPCR方法的檢測(cè)結(jié)果完全一致，符合率達(dá)100%。

2.5 國(guó)標(biāo)RT-PCR方法對(duì)盲傳3代雞胚尿囊液的檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)過(guò)檢測(cè)，國(guó)標(biāo)方法從6份尿囊液中檢測(cè)出了4份陽(yáng)性，2份陰性(圖4)，檢測(cè)結(jié)果與本試驗(yàn)建立的RT-nPCR方法完全一致。

3 討 論

新城疫是一種世界范圍流行的傳染病，目前仍是家禽重大疫病之一，在我國(guó)防控新城疫仍然任重道遠(yuǎn)。對(duì)于病毒性傳染病，及早進(jìn)行病原診斷是防控的重點(diǎn)措施之一[9]。新城疫的病原診斷方法主要有病毒分離鑒定、HA-HI試驗(yàn)、熒光抗體技術(shù)和RT-PCR。病毒分離鑒定、HA-HI試驗(yàn)是可靠的確診手段，但最大的缺點(diǎn)是需要進(jìn)行雞胚接種傳代，耗時(shí)較長(zhǎng)，不能快速診斷。熒光抗體檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是快速定性，缺點(diǎn)是靈敏度較低[10]。

隨著分子生物學(xué)研究資料的逐漸豐富，NDV基因序列不斷登錄GenBank，為設(shè)計(jì)特異性引物、建立RT-PCR診斷方法提供了豐富資料[11-13]。國(guó)標(biāo)《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T 16550-2008)中也規(guī)定了RT-PCR方法。但是在實(shí)際應(yīng)用中，筆者發(fā)現(xiàn)直接處理發(fā)病雞組織病料后用國(guó)標(biāo)RT-PCR法診斷結(jié)果不甚理想，很多臨床病例初次診斷均為陰性，但只要將組織樣品處理上清液接種雞胚1～3代，再次用國(guó)標(biāo)RT-PCR法診斷即轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，用HA-HI試驗(yàn)也證實(shí)分離到了NDV。該結(jié)果提示國(guó)標(biāo)RT-PCR法靈敏度不足，在組織病料中病毒含量很低的情況下，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接用于PCR擴(kuò)增很難擴(kuò)增到目的片段，目前尚未見到對(duì)國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化的公開報(bào)道。為了克服這一缺點(diǎn)，本研究采用了套式PCR技術(shù)，在國(guó)標(biāo)方法目的片段外再設(shè)計(jì)1對(duì)外擴(kuò)引物，以增加PCR擴(kuò)增的特異性和敏感性，建立了NDV RT-nPCR檢測(cè)方法。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化方法檢測(cè)的極限為5.6×10-5ng/L；特異性試驗(yàn)結(jié)果提示該方法對(duì)常見的其他6種禽病毒檢測(cè)均為陰性，只能從NDV中擴(kuò)增出目的條帶。在對(duì)6份組織病料的檢測(cè)對(duì)比中，原國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果均為陰性，改進(jìn)的RT-nPCR方法檢測(cè)出4份為陽(yáng)性結(jié)果。將此6份病料接種于雞胚傳3代，通過(guò)HA-HI試驗(yàn)證實(shí)，4份陽(yáng)性病料均分離到了NDV，2份陰性病料則未分離到NDV，RT-nPCR方法檢測(cè)結(jié)果與病毒分離結(jié)果相符率達(dá)100%。以上結(jié)果證明，建立的RT-nPCR方法靈敏度高、特異性好，能直接應(yīng)用于組織病料檢測(cè)，達(dá)到快速、準(zhǔn)確診斷的目的，節(jié)約了大量時(shí)間，為生產(chǎn)上迅速防控新城疫疫情提供了一種優(yōu)異的技術(shù)手段。另外，擴(kuò)增產(chǎn)物為F基因片段，包含了NDV強(qiáng)弱毒鑒別序列位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)基因測(cè)序后可為區(qū)分毒株致病性的強(qiáng)弱提供參考。

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Optimization and application of national standard based RT-PCR diagnostic technique for Newcastle disease

WU Xu-jin,ZHU Xiao-fu

(AnimalEpidemicDiseaseDiagnosticLaboratoryofMolecularBiology,InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,XianyangVocationalTechnicalCollege,Xianyang,Shaanxi712000,China)

【Objective】 Based on improvement and optimization of RT-PCR diagnostic technique for Newcastle disease,this study established a modified RT-PCR diagnostic technique (RT-nPCR),which was sensitive and specific for direct test of NDV from clinical tissue samples.【Method】 According to published GenBank NDV gene sequences,two pairs of primers were synthesized to detect NDV.The best conditions for the establishment of NDV RT-nPCR detection were obtained and sensitivity test,specificity test,direct tissue samples test and virus isolation test were carried out to verify the applicability and superiority of the RT-nPCR method.【Result】 The established method had high sensitivity with the detection limit of 5.6 ×10-5ng/L,and the objective band could be amplified only from NDV template.Using the RT-nPCR method,4 out 6 suspicious samples were detected positive,which was 100% in compliance with virus isolation method.On the contrary,the national standard RT-PCR did not identify any positive samples.【Conclusion】 A sensitive and specific RT-nPCR method for rapid NDV detection from clinical tissue samples was successfully established.

newcastle disease;diagnosis;RT-PCR

2013-11-01

咸陽(yáng)市2011年科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011K04-12)

吳旭錦(1979-)，女，陜西西安人，副教授，博士，主要從事納米藥物開發(fā)和動(dòng)物疫病分子病原學(xué)研究。

時(shí)間:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.028

S851.347.201

A

1671-9387(2015)03-0027-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.028.html