舒 楊，殷中瓊，趙 建，李 平，李太強(qiáng)，龍興發(fā)，朱鏈發(fā)

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安625014；2 四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064；3 四川省甘孜州畜牧業(yè)科學(xué)研究所，四川 康定 626000)

合歡皂苷顆粒劑對高原鼠兔的抗生育作用

舒 楊1，殷中瓊1，趙 建2，李 平3，李太強(qiáng)3，龍興發(fā)3，朱鏈發(fā)3

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安625014；2 四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064；3 四川省甘孜州畜牧業(yè)科學(xué)研究所，四川 康定 626000)

【目的】 研究合歡皂苷顆粒劑對高原鼠兔的抗生育作用，確定最佳用量，為高原鼠兔種群數(shù)量的控制提供參考。【方法】 用主藥量為135，270和540 mg/kg的合歡皂苷水溶液灌胃小鼠，進(jìn)行抗小鼠生育力試驗(yàn)，確定效果后換算為高原鼠兔的相應(yīng)劑量，制備成合歡皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.3%，0.6%和1.2%的顆粒劑，并進(jìn)行攝食系數(shù)研究，篩選出抗生育效果與適口性均良好的劑量，研究該顆粒劑對高原鼠兔懷孕率及生殖器官臨床剖檢和病理學(xué)的影響?！窘Y(jié)果】 主藥含量為540 mg/kg的合歡皂苷抗小鼠生育效果良好，對雄性小鼠的抗生育率可達(dá)63%，對雌性小鼠的抗生育率可達(dá)70%。通過換算，合歡皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的顆粒劑對高原鼠兔的抗生育率達(dá)70%，攝食系數(shù)可達(dá) 1.67。經(jīng)剖檢，可見雄性高原鼠兔輸精管充血，睪丸腫大；雌性高原鼠兔出現(xiàn)子宮充血、胎兒吸收等現(xiàn)象?！窘Y(jié)論】 合歡皂苷對雌、雄高原鼠兔均具有良好的抗生育作用，其作用靶點(diǎn)主要為生殖器官。

合歡皂苷；抗生育作用；顆粒劑；高原鼠兔

合歡(AlbiziajulibrissinDurazz)為落葉喬木植物，原產(chǎn)于我國和日本。有文獻(xiàn)報道，合歡中含皂苷、三萜、黃酮等多種成分[1]，其中主要成分為皂苷[2]。國內(nèi)有文獻(xiàn)報道合歡皂苷具抗腫瘤、抗抑郁、增強(qiáng)免疫等作用[3]。Chaudhary等[4]研究認(rèn)為，合歡具有抑制雄鼠精子發(fā)生的作用。

高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)是一種小型、非冬眠、食草性兔形目動物，廣泛分布于海拔3 200～5 300 m的青藏高原及周邊高寒草甸草原[5]，特別適合生存于高寒、缺氧的環(huán)境[6]，其生活方式為穴居，啃食牧草，挖洞推土，破壞生草層，且繁殖能力強(qiáng)[7]。由于其種群密度過高，近年來造成高山草甸地區(qū)家畜(牦牛、綿羊、馬等)牧草不足及草地退化等問題，已威脅到當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)生產(chǎn)的良性發(fā)展。因此，探索一種高效、綠色的控鼠手段已成為世界性的課題。由于傳統(tǒng)的滅鼠藥物對環(huán)境污染較大或只是單性不育劑，存在一定的不足，所以研發(fā)天然的、可使兩性不育的滅鼠劑，對于綠色、科學(xué)控制鼠害具有重要意義。

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)，合歡皂苷對雄性小鼠具有較好的抗生育作用，且合歡在世界范圍內(nèi)被廣泛種植，特別是我國南部和西南部地區(qū)，其種植面積已相當(dāng)可觀，具有廣泛的植物資源[8]。相比其他抗生育劑，合歡皂苷價格低廉，可大批量生產(chǎn)，且已被證實(shí)具有抗生育和抗早孕等作用。因此，將其作為有效的防治草原鼠害的植物性抗生育制劑，具有較高的可行性。本研究通過研究合歡皂苷對小鼠的抗生育作用，制備了適應(yīng)高原鼠兔量的合歡皂苷顆粒劑，并進(jìn)一步研究了該顆粒劑對高原鼠兔懷孕率及生殖器官的影響，探索合歡皂苷對高原鼠兔的抗生育作用機(jī)理，以期為今后將其應(yīng)用于草原鼠害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

合歡皂苷購于陜西慈緣生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：CY120512。合歡皂苷顆粒劑由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室制備[9]。

1.2 試驗(yàn)動物

選用健康性成熟昆明種清潔級小鼠，體質(zhì)量為25～30 g/只，購于成都達(dá)碩生物科技有限公司，合格證號：SCXK(川)2008-24。小鼠常規(guī)方法飼養(yǎng)(12 h光照/12 h黑暗，溫度(25±2) ℃，空氣相對濕度40%～75%)，自由采食。試驗(yàn)前預(yù)飼1周，觀察小鼠采食和飲水有無異常。

健康性成熟高原鼠兔捕捉于四川省甘孜藏族自治州石渠縣生物控鼠示范區(qū)，體質(zhì)量114.3～209.6 g/只，年齡為(4.5±0.5)月。

1.3 合歡皂苷對雄性小鼠的抗生育作用

取健康雄性性成熟昆明種小鼠60只，隨機(jī)分成3個試驗(yàn)組和1個對照組，每組15只。參考趙建國等[10]關(guān)于合歡皂苷的急性毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，低、中、高劑量組雄鼠分別灌胃135 mg/kg(Ⅰ組)、270 mg/kg(Ⅱ組)和540 mg/kg(Ⅲ組)的合歡皂苷水溶液(15 mL/kg)。對照組給予等量生理鹽水(15 mL/kg)。連續(xù)給藥1周后，將雄鼠分別與性成熟雌鼠按1∶2的數(shù)量比合籠，每日清晨陰道涂片檢查是否交配，發(fā)現(xiàn)精子后將雌鼠分籠飼養(yǎng)。雄鼠繼續(xù)灌胃至19 d，每周根據(jù)小鼠體質(zhì)量調(diào)整給藥量。于最后一次給藥30 min后處死，觀察合歡皂苷對雄性小鼠生殖器官的影響，統(tǒng)計(jì)各組小鼠的受孕率及抗生育率，抗生育率=對照組懷孕率-試驗(yàn)組懷孕率。

1.4 合歡皂苷對雌性小鼠的抗生育作用

取健康雌性性成熟昆明種小鼠80只，隨機(jī)分成3個試驗(yàn)組和1個對照組，每組20只。給藥劑量同1.3。連續(xù)給藥1周后，將雌鼠與正常雄鼠按2∶1的數(shù)量比合籠，每日清晨陰道涂片檢查是否交配，發(fā)現(xiàn)精子后將雌鼠分籠飼養(yǎng)。雌鼠繼續(xù)灌胃至19 d，每周根據(jù)小鼠體質(zhì)量調(diào)整給藥量。于最后一次給藥30 min后處死，觀察合歡皂苷對雌性小鼠生殖器官的影響，統(tǒng)計(jì)各組小鼠的受孕率及抗生育率。

1.5 合歡皂苷顆粒劑對高原鼠兔攝食系數(shù)的影響

由于高原鼠兔屬兔形目，與小鼠不同，因此需要根據(jù)小鼠的劑量換算后進(jìn)行試驗(yàn)。以每只小鼠體質(zhì)量27 g、每只高原鼠兔150 g計(jì)算，低、中、高劑量組小鼠19 d攝取主藥量分別為135，270和540 mg/kg，其對應(yīng)的合歡皂苷的有效成分分別為 69.25，138.5和277 mg。根據(jù)公式Db=Da·(Kb/Ka)·(Wb/Wa)2/3(Da、Db分別表示每只小鼠、鼠兔的劑量，K表示動物體型系數(shù)(小鼠的體型系數(shù)Ka=0.089 9，鼠兔的體型系數(shù)Kb=0.101 4)，Wa、Wb分別表示每只小鼠、鼠兔的體質(zhì)量[11])進(jìn)行換算，制備相應(yīng)含量的合歡皂苷顆粒劑[9]。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定，低、中、高劑量的顆粒劑中合歡皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.3%(Ⅰ組)、0.6%(Ⅱ組)和 1.2%(Ⅲ組)。參照全國農(nóng)藥檢定所規(guī)定的方法進(jìn)行攝食系數(shù)研究，取健康性成熟高原鼠兔120只，分成3個試驗(yàn)組和1個對照組，每組30只，雌、雄各半，分籠飼養(yǎng)[12]。試驗(yàn)組每個高原鼠兔籠內(nèi)分別放置不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的合歡皂苷顆粒劑和普通牧草各90 g，對照組只放普通牧草，讓其自由采食，持續(xù)7 d，并于每日上午09:00統(tǒng)計(jì)各組攝食量，計(jì)算攝食系數(shù)(攝食系數(shù)=攝食抗生育顆粒劑平均量/攝食牧草的平均量)，判斷合歡皂苷顆粒劑的適口性[12-13]。判斷標(biāo)準(zhǔn)為：攝食系數(shù)>0.5，表明適口性優(yōu)；0.3<攝食系數(shù)≤0.5，表明適口性良；0.3≤攝食系數(shù)≤0.1，表明適口性中；攝食系數(shù)<0.1，表明適口性差[14-15]。以適口性好的顆粒劑進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 合歡皂苷顆粒劑對高原鼠兔的抗生育作用

在甘孜藏族自治州石渠縣布設(shè)的生物控鼠示范區(qū)域進(jìn)行投藥，分為對照區(qū)(Ⅱ組，投放普通牧草)、試驗(yàn)區(qū)(Ⅲ組，投放合歡皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的顆粒劑)和自然受孕區(qū)(Ⅰ組，不投任何食物)。投藥1個月后，在3個區(qū)域內(nèi)通過捕鼠器分別捕捉高原鼠兔60只(雌、雄各半)，剖檢并觀察畸形胎或死胎，統(tǒng)計(jì)胎子數(shù)[16]，計(jì)算抗生育率。同時采集雄性高原鼠兔的睪丸、附睪及雌性高原鼠兔的子宮、卵巢，觀察并記錄高原鼠兔生殖器官的臨床變化[17]，然后將其固定于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下檢查[1，18]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 合歡皂苷對雄性小鼠的抗生育作用

合歡皂苷對雄性小鼠的抗生育力試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，對照組小鼠懷孕率為83%，低(Ⅰ組)、中(Ⅱ組)、高(Ⅲ組)劑量組小鼠的抗生育率分別為50%，56%和63%；與對照組相比，主藥用量為540 mg/kg的合歡皂苷抗雄性小鼠生育力作用最明顯。

2.2 合歡皂苷對雌性小鼠的抗生育作用

合歡皂苷抗雌性小鼠生育力的試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，對照組小鼠懷孕率為85%，低(Ⅰ組)、中(Ⅱ組)、高(Ⅲ組)劑量組抗生育率分別為25%，40%和70%；與對照組相比，主藥用量為540 mg/kg的合歡皂苷抗雌性小鼠生育力作用最明顯。

2.3 合歡皂苷顆粒劑對高原鼠兔攝食系數(shù)的影響

各劑量合歡皂苷顆粒劑對高原鼠兔攝食系數(shù)的影響結(jié)果見表3。由表3可知，高原鼠兔對合歡皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%顆粒劑(Ⅲ組)的攝食系數(shù)最高，且顯著高于合歡皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%和0.6%的顆粒劑(P<0.05)。表明合歡皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的顆粒劑對高原鼠兔的適口性較好，因此可將其作為合歡皂苷在顆粒劑中的最佳主藥含量。

2.4 合歡皂苷顆粒劑對高原鼠兔的抗生育作用

2.4.1 對懷孕率的影響 合歡皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的顆粒劑(Ⅲ組)對高原鼠兔的抗生育結(jié)果見表4。由表4可知，自然受孕組(Ⅰ組)雌性高原鼠兔懷孕率為93%，對照組(Ⅱ組)雌性高原鼠兔懷孕率為83%，試驗(yàn)組(Ⅲ組)雌性高原鼠兔懷孕率為23%，即抗生育率為70%。

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

注：Different lowercase letters in each column indicate significant difference (P<0.05).

2.4.2 對生殖器官臨床剖檢的影響 臨床剖檢觀察結(jié)果表明，試驗(yàn)組雄性高原鼠兔可見輸精管充血(圖1-A)及睪丸腫大、充血等現(xiàn)象(圖1-B)；雌性高原鼠兔可見子宮充血、出血等現(xiàn)象(圖1-C)，甚至可見吸收胎(圖1-D)；懷孕的高原鼠兔無死胎或畸形胎現(xiàn)象，且其他臟器無明顯病變。

2.4.3 對生殖器官的病理學(xué)影響 對照組高原鼠兔睪丸從基膜向內(nèi)觀察，可見處于不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞、支持細(xì)胞和管腔中的精子(圖2-A)；試驗(yàn)組高原鼠兔睪丸間質(zhì)減少，曲細(xì)精管萎縮，管腔內(nèi)各級生精細(xì)胞排列疏松，并脫落于管腔中，同時可見管腔內(nèi)精子減少(圖2-B)。

對照組高原鼠兔附睪管管腔完整，可見假復(fù)層柱狀黏膜，管腔內(nèi)可見大量精子及分泌物(圖3-A)；試驗(yàn)組高原鼠兔附睪管外間質(zhì)減少，管腔內(nèi)精子及分泌物幾乎消失(圖3-B)。

對照組雌性高原鼠兔子宮由內(nèi)向外可見子宮內(nèi)膜、子宮肌層及子宮外膜排列緊密，子宮腺具正常形態(tài)(圖4-A)；試驗(yàn)組高原鼠兔子宮黏膜層、固有層、肌層有不同程度的充血現(xiàn)象，并可見子宮腺增厚(圖4-B)。

對照組雌性高原鼠兔卵巢中可見不同發(fā)育階段的卵泡，呈球狀，具正常結(jié)構(gòu)、形態(tài)(圖5-A)；試驗(yàn)組雌性高原鼠兔卵巢中可見血管有充血現(xiàn)象，且成熟卵泡的顆粒細(xì)胞溶解，脫落于卵泡腔內(nèi)(圖5-B)。

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明：540 mg/kg的合歡皂苷抗雄性小鼠生育率可達(dá)63%，抗雌性小鼠生育率可達(dá)70%，該結(jié)果為后期的推廣示范提供了用量基礎(chǔ)，使應(yīng)用更具可靠性。

鼠類的攝食習(xí)性和行為與其對營養(yǎng)的需求有關(guān)，決定了鼠類對不同食物的不同嗜好。高原鼠兔長年生活在地下，以植物根莖為食物，防治起來比較困難[14]。攝食系數(shù)是評價藥物適口性的常用指標(biāo)，具有較好的客觀性，可排除空間和環(huán)境因素對害鼠自由采食的影響[9]。本研究表明，高原鼠兔對合歡皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%，0.6%和1.2%的顆粒劑的攝食系數(shù)均大于0.5，適口性較好，且以合歡皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%的顆粒劑適口性最好，可將其作為兩性不育滅鼠顆粒劑應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在野外環(huán)境中，合歡皂苷顆粒劑對高原鼠兔的抗生育率可達(dá)70%。臨床剖檢中，可見雌、雄高原鼠兔生殖器官病變。本研究發(fā)現(xiàn)，合歡皂苷顆粒劑主要引起雄性鼠兔睪丸、附睪精子減少。有研究表明，合歡皂苷可破壞并通過血睪屏障直接殺傷精子，從而使小鼠精子活率降低、畸形率升高；同時，合歡皂苷對睪丸、附睪等生殖器官也有一定程度的損傷，導(dǎo)致雄性不育[19]。國外有文獻(xiàn)報道，合歡皂苷可通過減少睪丸、附睪等生殖器官的質(zhì)量及降低精子活力等途徑使雄性大鼠不育，但無明顯毒副作用[20]；國內(nèi)關(guān)于合歡皮的報道稱，合歡提取物具有顯著的抗生育作用；同時，合歡抗生育的有效成分為皂苷，有致流產(chǎn)作用[3]。這與本試驗(yàn)結(jié)果相似，說明合歡皂苷顆粒劑具有可靠的抗生育作用。

合歡皂苷顆粒劑對雌性高原鼠兔生殖器官的病理學(xué)影響主要表現(xiàn)為引起子宮、卵巢的病理變化，包括對卵泡細(xì)胞和子宮各肌層的損傷，如引起各級卵泡細(xì)胞胞腔充血，部分卵泡細(xì)胞出現(xiàn)核碎裂、核濃縮，炎性細(xì)胞浸潤；引起子宮不同程度出血、充血、水腫及炎癥。蔚冬紅等[3]指出，合歡皮的抗生育作用機(jī)理在于殺傷胚胎的滋養(yǎng)層細(xì)胞。說明合歡皂苷顆粒劑作為抗生育劑可使雌性高原鼠兔生殖器官發(fā)生病變，導(dǎo)致其懷孕率降低。但其有關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，合歡皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的顆粒劑對高原鼠兔具有良好的適口性，其對雌、雄高原鼠兔均有良好的抗生育作用，具有很好的應(yīng)用價值，有望應(yīng)用于草原鼠害的控制。

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Anti-fertility effect ofAlbiziasaponin granules onOchotonacurzoniae

SHU Yang1,YIN Zhong-qiong1,ZHAO Jian2,LI Ping3,LI Tai-qiang3,LONG Xing-fa3,ZHU Lian-fa3

(1CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China;2CollegeofLifeSciences,SichuanUniversity,Chengdu,Sichuan610064,China;3GanziPrefectureInstituteofAnimalScience,Kangding,Sichuan626000,China)

【Objective】 This study investigated the anti-fertility effect ofAlbiziasaponin onOchotonacurzoniaeand determined the optimal dose to improve the control ofO.curzoniae.【Method】 Saponin solution fromAlbiziawas fed to mice with the doses of 135,270 and 540 mg/kg to test the anti-fertility effects on mice.The optimal dose was determined and conversed to corresponding dose forO.curzoniae.Granules with mass fractions of 0.3%,0.6% and 1.2% were prepared and feeding coefficient study was conducted to select the optimal dosage with both good anti-fertility effect and palatability.Then the anti-fertility effect on pregnant rate and pathology ofO.curzoniaewas investigated.【Result】 Saponin fromAlbiziaat the dose of 540 mg/kg had well anti-fertility effect with the anti-fertility rates of 63% and 70% to male and female mice,respectively.The conversed anti-fertility rate againstO.curzoniaewas 70% with the feeding coefficient of 1.67.After necropsy,vas deferens congestion and testis swelling and congestion were observed in males while uterus congestion and absorption embryo were observed in females.【Conclusion】 Saponin fromAlbiziahad strong anti-fertility effect onO.curzoniae,and the main targets were reproductive organs.

saponin fromAlbizia;anti-fertility effect;granules;Ochotonacurzoniae

2013-10-23

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(xiàng)科研經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201203041)；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 (13ZC1635)

舒 楊(1989-)，女，四川成都人，碩士研究生，主要從事鼠害防治研究。E-mail:jessieshuyang@126.com

殷中瓊(1968-)，女，重慶人，教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物研究。E-mail:yinzhongq@163.com

時間:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.027

S859.83

A

1671-9387(2015)03-0020-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.027.html