易治鑫，蔣易龍，王秋宏，徐麒麟，王新興，莫桂林，姜冬梅，康波*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都611130；2.巴中市農(nóng)林科學(xué)研究院，四川 巴中636000；3.成都市農(nóng)林科學(xué)院，成都611130）

多胺（主要包括腐胺、亞精胺和精胺）能作為內(nèi)源性免疫調(diào)節(jié)因子參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，精胺作為內(nèi)源性細(xì)胞因子抑制劑，能抑制白細(xì)胞介素-1（interleukin-1, IL-1）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的合成[3-5]。HASKó 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，精胺不僅能抑制脾細(xì)胞釋放γ-干擾素（interferon-γ,IFN-γ），還能抑制巨噬細(xì)胞翻譯白細(xì)胞介素-12（interleukin-12, IL-12），進(jìn)而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。CAO 等[6]通過在仔豬日糧中添加0.4 mmol/kg 精胺發(fā)現(xiàn)，精胺不僅能顯著抑制胸腺和脾中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 基因表達(dá)，同時(shí)還能顯著提高IgM、IL-10 及轉(zhuǎn)化生長因子β1 基因的表達(dá)。該結(jié)果提示精胺能介導(dǎo)免疫相關(guān)因子基因的表達(dá)，從而影響機(jī)體正常生理狀態(tài)下的免疫功能。此外，當(dāng)母乳中精胺濃度低于2 nmol/L 時(shí)，80%的新生兒會出現(xiàn)過敏反應(yīng)；而精胺濃度在13 nmol/L 以上時(shí)，過敏癥狀發(fā)生概率將顯著降低[7]。這說明精胺對幼齡動物的免疫能力具有調(diào)控作用。綜上所述，精胺能介導(dǎo)免疫因子參與的機(jī)體免疫調(diào)控。

胸腺、脾和法氏囊作為禽類重要的免疫器官，是產(chǎn)生免疫細(xì)胞和免疫因子的主要場所[8]；肝不僅能參與代謝和解毒，在禽類免疫功能中也具有十分重要的作用。我們的前期研究表明，精胺可通過介導(dǎo)鵝卵泡顆粒細(xì)胞雌激素受體和促黃體激素受體基因表達(dá)來參與調(diào)控雌鵝卵巢功能[9-10]。然而，目前尚未見精胺對雌鵝免疫器官指數(shù)和免疫相關(guān)因子基因表達(dá)影響的研究報(bào)道。因此，本研究用不同濃度精胺灌喂四川白鵝雌鵝2 周后，測定肝、胸腺、脾和法氏囊的免疫器官指數(shù)，并定量檢測肝、胸腺、脾和法氏囊組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 基因的表達(dá)量，以明確外源性精胺對雌鵝免疫器官指數(shù)和免疫相關(guān)因子基因表達(dá)的影響，為探究精胺調(diào)控家禽免疫功能的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及樣品采集

隨機(jī)選取四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽育種實(shí)驗(yàn)場同批孵化、相同環(huán)境飼養(yǎng)的成年四川白鵝母鵝18 只，隨機(jī)分為3組（n=6），自由采食和飲水。對照組灌喂禽用生理鹽水，試驗(yàn)組根據(jù)鵝體質(zhì)量分別灌喂5 mg/kg和10 mg/kg 精胺，每日于8：00 和20：00 進(jìn)行灌喂。灌喂2周后，于頸部放血處死，迅速采集鵝肝、胸腺、脾和法氏囊組織，稱量，用于后續(xù)試驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)操作都嚴(yán)格按照四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物操作規(guī)范與福利管理委員會制定的《實(shí)驗(yàn)動物操作規(guī)范》（川農(nóng)大校發(fā)〔2014〕18號）進(jìn)行。

1.2 免疫器官指數(shù)測算

鵝肝、胸腺、脾和法氏囊組織的器官指數(shù)計(jì)算公式如下：免疫器官指數(shù)/（g/kg）=免疫器官鮮質(zhì)量/g÷活體質(zhì)量/kg。

1.3 組織總RNA 提取和cDNA 制備

參照Trizol 試劑（TaKaRa 公司，大連）操作說明書提取組織樣品總RNA，并取3 μL 總RNA 通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，大連）操作說明書制備cDNA。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）體系：iTaqTM通用型SYBR Green超預(yù)混液（Bio-Rad Laboratories, CA, USA）5 μL，上游和下游引物各0.2 μL，cDNA 模板0.5 μL，無RNA酶水4.1 μL，共10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，根據(jù)引物退火溫度（表1）分別退火30 s，72 ℃延伸30 s并采集熒光，共45個(gè)循環(huán)。繪制熔解曲線。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

表1 引物序列信息Table 1 List of primer sequences

1.5 免疫器官組織多胺含量檢測

參照KANG 等[10]報(bào)道的方法，采用苯甲酰氯柱前衍生并聯(lián)合高效液相色譜檢測鵝肝、胸腺、脾和法氏囊組織中的多胺含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)分析軟件的均值過程進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝免疫器官組織RNA 提取及免疫相關(guān)因子基因擴(kuò)增結(jié)果

如圖1 所示，鵝肝、胸腺、脾和法氏囊組織總RNA的28S和18S片段條帶清晰，未產(chǎn)生降解的5S片段，表明肝、胸腺、脾和法氏囊組織總RNA質(zhì)量良好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

如圖2 所示，利用已提取的鵝免疫器官組織總RNA（以肝為例），對TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ 和GAPDH基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果表明，目的基因片段條帶單一，大小與預(yù)期片段相一致；此外，如圖3所示，TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和GAPDH基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR熔解曲線呈現(xiàn)單一峰型，表明引物特異性高。因此，本文所設(shè)計(jì)的免疫因子基因引物可用于后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。

圖1 鵝免疫器官組織總RNA電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of total RNA in the immune organ of female geese

圖2 鵝肝組織目的基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of RT-PCR products for target genes in the liver of female geese

圖3 目的基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR熔解曲線Fig.3 Melt curves of real-time quantitative PCR amplifications of target genes

2.2 精胺對雌鵝免疫器官指數(shù)的影響

如圖4所示：5 mg/kg精胺灌喂組肝指數(shù)與對照組無顯著差異（P＞0.05），而10 mg/kg精胺灌喂組鵝肝指數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05）；不同濃度精胺處理對雌鵝胸腺、脾和法氏囊指數(shù)均無顯著影響（P＞0.05）。

圖4 精胺對鵝免疫器官指數(shù)的影響Fig.4 Effects of spermine on immune organ indexes of the liver,thymus,spleen and bursa of Fabricius in female geese

2.3 精胺對鵝免疫器官免疫相關(guān)因子基因表達(dá)的影響

由圖5 可知：不同濃度精胺灌喂對鵝肝組織TNF-α、IL-1β 和IL-6 基因表達(dá)較對照無顯著影響（P＞0.05），在10 mg/kg 精胺灌喂組的鵝肝組織中IFN-γ 表達(dá)量顯著低于對照組，是對照組的39.37%（P＜0.05）。5 mg/kg 精胺灌喂后，鵝胸腺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 基因表達(dá)量均顯著低于對照組（P＜0.05），分別是對照組的40.00%、45.88%、45.30%和11.00%，10 mg/kg 精胺處理對鵝胸腺TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 基因表達(dá)無顯著影響（P＞0.05）。5 mg/kg 和10 mg/kg精胺灌喂后，鵝脾組織IFN-γ 基因表達(dá)量分別是對照組的46.45%和39.04%（P＜0.05），而對脾組織TNF-α、IL-1β 和IL-6 基因表達(dá)均無顯著影響（P＞0.05）。5 mg/kg精胺處理組的鵝法氏囊TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 基因表達(dá)量分別是對照組的32.84%、49.46%、27.89% 和19.97%（P＜0.05）；10 mg/kg精胺處理組的法氏囊TNF-α和IFN-γ基因表達(dá)量分別是對照組的78.51%和81.82%（P＜0.05）。

圖5 精胺對鵝免疫相關(guān)因子基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of spermine on expression levels of genes related to immune factors in female geese

2.4 精胺對鵝免疫器官多胺代謝的影響

如圖6 所示：外源性精胺處理顯著提高了鵝肝組織精胺含量（P＜0.05），而對腐胺和亞精胺含量均無顯著影響（P＞0.05）；10 mg/kg精胺處理顯著增加了法氏囊組織腐胺含量（P＜0.05），顯著降低了精胺含量（P＜0.05），而對亞精胺水平無顯著影響（P＞0.05）；不同濃度精胺對鵝脾和胸腺組織中腐胺、亞精胺和精胺含量均無顯著影響（P＞0.05）。

3 討論與結(jié)論

多胺可作為內(nèi)源性免疫調(diào)節(jié)因子，在調(diào)控機(jī)體免疫功能中發(fā)揮著重要作用[11-12]。本實(shí)驗(yàn)室人員前期研究發(fā)現(xiàn)，在正常生理?xiàng)l件下低濃度亞精胺能抑制小鼠TNF-α 和IL-1β 基因的表達(dá)，而高濃度亞精胺則會促進(jìn)IL-6和IFN-γ基因的表達(dá)，提示免疫相關(guān)因子表達(dá)對亞精胺存在劑量依賴性[13]。OKUMURA 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，多胺能顯著降低大鼠肝缺血再灌注后血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 和IFN-γ的水平，對趨化因子也有顯著抑制作用。此外，研究表明，在小膠質(zhì)細(xì)胞和急性胰腺炎中，多胺具有抑制TNF-α和IL-6基因表達(dá)的作用[14-15]。

胸腺、法氏囊和脾是禽類主要的免疫器官[16]，而胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)和脾指數(shù)能夠反映機(jī)體免疫水平，在判斷禽類免疫功能中具有重要意義[17]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥、致敏及感染組織中精胺含量顯著升高，提示精胺在炎癥和致敏等病理過程中發(fā)揮著重要作用[5,18]。本研究結(jié)果表明：不同濃度精胺灌喂對鵝胸腺指數(shù)、脾指數(shù)和法氏囊指數(shù)無顯著影響，在脾和胸腺組織中腐胺、亞精胺和精胺含量均無顯著變化；10 mg/kg精胺處理顯著下調(diào)鵝肝指數(shù)，同時(shí)，肝組織中精胺水平顯著升高，提示外源性精胺在不同組織中沉積具有組織特異性，肝組織對外源性精胺處理更加敏感。另外，10 mg/kg精胺處理后，鵝法氏囊組織精胺水平顯著降低，而腐胺水平顯著增加，提示外源性精胺可能加速了法氏囊組織中的多胺分解代謝，促使精胺向腐胺轉(zhuǎn)化。這進(jìn)一步說明不同組織中的多胺代謝能力及其對精胺的耐受量可能存在差異。

圖6 精胺對鵝免疫器官組織多胺水平的影響Fig.6 Effects of spermine on polyamine contents in the liver,thymus,spleen and bursa of Fabricius of female geese

精胺能通過發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)因子功能參與調(diào)控機(jī)體的免疫功能。ZHANG等[19-20]研究發(fā)現(xiàn)，精胺能抑制脂多糖誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞TNF-α的釋放，提示精胺具有參與調(diào)控人免疫功能的潛力。HASKó等[1]也發(fā)現(xiàn)，精胺能通過介導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL 的分泌來參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫。高水平TNF-α、IL-1β 和IL-6能誘導(dǎo)組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，而精胺在轉(zhuǎn)錄水平上能通過抑制TNF-α、IL-1β 和IL-6 基因表達(dá)進(jìn)而參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[2,21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，5 mg/kg精胺處理后，鵝胸腺和法氏囊組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 基因表達(dá)量均顯著降低，與上述研究結(jié)果相似，進(jìn)一步說明精胺可介導(dǎo)胸腺和法氏囊組織中TNF-α、IL-1β和IL-6基因表達(dá)，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控機(jī)體免疫功能。同時(shí)，10 mg/kg 精胺對胸腺和法氏囊組織中IL-1β 和IL-6 表達(dá)無顯著影響，提示精胺介導(dǎo)胸腺和法氏囊中IL-1β和IL-6的表達(dá)可能具有劑量依賴性。此外，外源性精胺處理后，鵝肝和脾組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 基因表達(dá)量相較于對照組并未發(fā)生顯著變化，提示精胺對TNF-α、IL-1β和IL-6基因表達(dá)的調(diào)控可能具有組織特異性。

IFN-γ是由T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等分泌的Ⅱ型干擾素[23]，可通過激活效應(yīng)免疫細(xì)胞、促進(jìn)抗原呈遞進(jìn)而發(fā)揮其抗菌、抗病毒和抗腫瘤作用[24-25]。有研究發(fā)現(xiàn)，精胺對脾組織中IFN-γ合成釋放有抑制作用，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體免疫能力[1]。在日糧中添加精胺能抑制仔豬胸腺和脾組織中IFN-γ基因表達(dá)[6]。本研究結(jié)果表明，外源性精胺顯著抑制鵝脾中IFN-γ基因表達(dá)，5 mg/kg精胺可抑制胸腺和法氏囊中IFN-γ基因表達(dá)，這與上述結(jié)果相似，說明精胺不僅能通過翻譯水平調(diào)控脾組織中IFN-γ 合成，還能在轉(zhuǎn)錄水平上影響脾組織中IFN-γ基因的表達(dá)[1,6]。

總之，本研究結(jié)果表明，精胺可通過介導(dǎo)雌鵝免疫相關(guān)因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 基因表達(dá)來參與調(diào)控鵝免疫功能，并存在劑量依賴性和組織特異性。