miR-9在骨肉瘤中的表達及臨床相關(guān)性探討

尤建宇，王文軍，張寧，劉波，趙寶林*

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科，吉林 長春130033)

骨肉瘤好發(fā)于青少年，約占所有惡性骨腫瘤的35%[1].傳統(tǒng)治療方法雖然能有效的提高骨肉瘤患者的術(shù)后生存率，但是仍有部分患者發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移。miRNA是一種長度約為22bp的非編碼單鏈RNA,它與靶基因3’端互補配對，降解或抑制靶基因表達，從而影響腫瘤細胞的生長、凋亡等病理過程[2-4]。已有研究表明miR-9在喉鱗癌、鼻咽癌、卵巢癌等腫瘤細胞中呈低表達水平[5-7]，但它在骨肉瘤的表達與臨床病理學關(guān)系卻鮮有報道。本研究檢測了miR-9 在骨肉瘤組織中的表達水平，并分析其表達與臨床病理學之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1骨肉瘤組織的來源選擇2011年9月到2013年6月在吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院的32例骨肉瘤患者。選取標準如下：①臨床病理學檢查和影像學證實為骨肉瘤；②均為原發(fā)于四肢的骨肉瘤，無一例在術(shù)前行化學或者放射治療。切取骨肉瘤組織和癌旁正常組織為實驗樣本，即刻放入液氮中保存，隨后保存于-80℃冰箱。

1.2主要試劑RNA提取所需TRLzol reagent以及電泳所需瓊脂糖購自Invitrogen公司、DNA提取試劑盒。qPCR逆轉(zhuǎn)錄、SYBR Premix Ex TaqⅡ、引物、SYBR○RPrimeScript○RmiRNA RT-PCR Kit (Perfect Real Time)試劑盒均購自上海吉瑪公司。

1.3RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)TRLzol reagent(Invitrogen)說明書抽提RNA，用紫外分光光度計監(jiān)測A260/A280比值，并檢測RNA的純度和濃度，使用吉瑪試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR。

1.4miRNA靶基因信息學預(yù)測使用Star Base 2.0、DIANA LAB和PicTar進行靶基因預(yù)測，分類匯總miRNA-9的潛在靶基因，2以上的網(wǎng)站預(yù)測的靶基因認為是其可能靶基因。

1.5qRT-PCR驗證表達水平差異較大的miRNA將1 000 ng RNA加入20 μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系進行逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR儀驗證差異表達的miRNA和靶基因，U6作為實驗內(nèi)參，GAPDH引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；擴增條件：95℃變性30 s，95℃變性25 s，60℃退火延伸25 s，50個循環(huán)。hsa-miR-9引物的序列：5′-TCTTTG GTTATCTAGCTGTATGA-3′。擴增條件：95℃變性30 s，95℃變性20 s，60℃退火延伸30 s，45個循環(huán)。SRPK-1引物序列：5′-CACGGCATGCATGGCCTTTGA-3′和5′-CGGCGGCAGTGGCTCTCTTC-3′。

1.6統(tǒng)計學分析使用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學計算。兩組計量資料使用非獨立樣本t檢驗，使用方差分析多組計量資料,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。用Origin7.5軟件繪制數(shù)據(jù)圖形。

2結(jié)果

2.1miR-9擴增曲線圓滑，為單峰型，顯示為特異性擴增。融解曲線的特異性也較好(如圖1所示)。

圖1　miR-9的擴增曲線及其融解曲線

2.2　miR-9在骨肉瘤和癌旁正常骨組織中的表達水平

miR-9在骨肉瘤和癌旁正常骨組織中均有表達，與癌旁正常骨組織相比，miR-9在骨肉瘤組織的表達水平呈降低趨勢(如圖2，P<0.05)；

圖2　miR-9在骨肉瘤組織和癌旁正常骨組織中的表達水平

2.3　miR-9在骨肉瘤中的表達水平和臨床病理學關(guān)系

根據(jù) miR-9表達的中位值,骨肉瘤患者被分為兩組:低表達組(n=18)和高表達組(n=14)。miR-9與骨肉瘤患者的年齡、性別、腫瘤分型和分期無顯著關(guān)系(P>0.05)。 (如表1)。

2.4　RT-PCR法檢測SRPK-1 mRNA在骨肉瘤組織和癌旁正常骨組織中的表達水平

實驗表明SRPK-1 mRNA的表達水平在骨肉瘤組織和癌旁正常骨組織沒 有顯著差異(如圖3,P>0.05)

2.5　雙變量相關(guān)性分析miR-9和SRPK-1在骨肉瘤中的表達關(guān)系

Spearman 雙變量相關(guān)性分析顯示SRPK-1與miR-9呈顯著的負相關(guān)(r=-0.973,如圖4，P<0.05)。

表1　miR-9表達與骨肉瘤患者的年齡、性別、腫瘤分型和

圖3　SRPK-1 mRNA在骨肉瘤組織和癌旁正常骨組織中

圖4　雙變量相關(guān)性分析miR-9和SRPK-1在骨肉瘤中的

3討論

研究表明[8，9]miRNA的表達譜在腫瘤組織和癌旁正常組織之間存在差異表達,然而，不同個體的相同組織間表達水平卻趨于一致。所以，比較miRNA在腫瘤實體組織和癌旁組織之間的表達水平差異,可能有助于找到診斷腫瘤的分子標志物[10-11]。

miR-9在多種惡性腫瘤中呈低表達水平，本研究發(fā)現(xiàn)miR-9在骨肉瘤組織和癌旁正常組織中存在顯著的差異表達，而且miR-9在骨肉瘤組織中呈低表達,與之前研究較一致[4-6]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)miR-9在原發(fā)骨腫瘤中比轉(zhuǎn)移腫瘤具有較高的水平,表明miR-9可能參與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移和進展。

本實驗首次分析骨肉瘤組織及癌旁正常骨組織中miR-9的表達水平，發(fā)現(xiàn)84.4%的骨肉瘤患者組織中miR-9表達下調(diào)。說明 miR-9低表達可以作為骨肉瘤的診斷指標；而SRPK-1蛋白與 miR-9表達的負相關(guān)則提示SRPK-1可能是miR-9的調(diào)控靶點。

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收稿日期：(2014-01-23)

文章編號：1007-4287(2015)01-0027-03

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