楊曉煜 任冬冬

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·基礎研究·

新型光纖二氧化碳激光豚鼠鼓膜造孔術實驗學研究△

楊曉煜 任冬冬

目的 研究新型光纖二氧化碳(CO2)激光行鼓膜造孔術的可行性及對內(nèi)耳結構和功能的影響。方法 40只豚鼠隨機分為4組(1、2、3 W和3 W+生理鹽水組)，前3組使用不同功率激光(1、2、3 W)在左耳鼓膜緊張部前下圓形造孔，第4組在左耳鼓室內(nèi)注射生理鹽水后再行3 W激光打孔。右耳均使用細針機械圓形造孔。比較各組穿孔愈合時間，術前和術后即刻、術后2周處死前行聽性腦干反應檢查了解聽覺功能，術后2周行掃描電鏡觀察毛細胞超微結構的變化。結果 CO2激光造孔愈合時間較機械造孔明顯延長(P<0.01);3 W 組激光造孔后出現(xiàn)耳蝸局部炭化，聽閾不可逆升高，耳蝸外毛細胞靜纖毛倒伏和脫落。鼓室注射生理鹽水后行3 W激光鼓膜打孔也出現(xiàn)聽閾不可逆升高，但是術后2周聽閾有部分恢復，耳蝸毛細胞損傷輕微。結論 新型光纖CO2激光豚鼠鼓膜造孔術只要激光功率選擇合適，臨床治療分泌性中耳炎伴有鼓室積液更安全、有效。 (中國眼耳鼻喉科雜志，2015，15：185-188)

激光；鼓膜；穿孔；耳蝸；豚鼠

近年來，激光已被廣泛用于耳科疾病的手術治療，以損傷小、定位精確、并發(fā)癥少著稱。手術中使用二氧化碳(CO2)激光已有20多年的歷史。既往的CO2激光器必須與顯微鏡聯(lián)合使用，使其廣泛應用于各種精確手術，特別是耳科、聲帶手術。但是，通過導光臂輸出的激光束，有時很難進入一些咽喉或是有角度的部位，因為激光束必須沿直線傳播。為了解決這一問題，新型柔軟的CO2激光光纖得以發(fā)明和應用。本實驗通過研究CO2激光行鼓膜造孔術對內(nèi)耳結構和聽覺功能的影響，初步探討這種新型光纖CO2激光在耳科應用的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 選用耳廓反射靈敏、電耳鏡檢查證實鼓膜正常，體重為250～400 g的健康紅目雄性豚鼠(本院提供)40只，隨機分為4組(1、2、3 W和 3 W+生理鹽水組)，每組10只。前3組使用不同功率激光(1、2、3 W)在左耳鼓膜緊張部前下圓形造孔，第4組左耳鼓室內(nèi)注射生理鹽水后再行3 W激光打孔。右耳均使用細針機械圓形造孔，直徑約0.5 mm(顯微鏡下用鉤針測量直徑大小)。分別于術后2周斷頭處死豚鼠。

1.2 激光照射方法 使用氯胺酮(40 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)混合液肌內(nèi)注射麻醉成功后，在手術顯微鏡(OPMI 9-FC，Zeiss公司，德國)下，采用新型CO2激光治療機和FiberLase CO2激光光纖(AcuPulse 40WG，Lumenis公司，美國)，光纖輸出端光斑直徑為485 μm，工作距離3 mm(由于激光散射角很小，所以光纖的工作距離可以達到3 mm，而且無需與組織接觸)。使用脈沖(SP)模式1次，持續(xù)0.1 s。以左耳為激光照射耳，分別以1 W(54.1 J/cm2)、2 W(108.2 J/cm2)和3 W(162.3 J/cm2)行鼓膜前下象限打孔，造孔直徑約0.5 mm。激光造孔術后每天在電耳鏡下觀察和記錄穿孔愈合情況。

1.3 聽性腦干反應閾值的檢測 在隔聲靜電屏蔽室內(nèi)，分別于術前半小時，術后即刻和術后2周行雙耳聽性腦干反應(auditory brainstem response，ABR)檢測。ABR檢測使用聽覺腦干誘發(fā)電位儀(AEP windows V 1.3.0, Bio-Logic公司，美國)，以click短聲刺激。參考電極接于測試耳耳垂或乳突皮下，記錄電極接于顱頂雙耳中間，接地電極接于對側耳耳垂或乳突部皮下。該機器對于正常豚鼠使用耳塞測試的正常聽閾為 30 dB SPL左右。

1.4 耳蝸標本掃描電鏡的制作 術后2周各組檢測ABR后，斷頭處死豚鼠，分別快速取出聽泡，在立體顯微鏡(解剖顯微鏡)(Stemi 2000，Zeiss公司，德國)下刺破圓窗膜，從蝸尖行2.5%戊二醛灌注并固定12 h，立體顯微鏡下按耳蝸鋪片法，剝?nèi)ノ仛?，除去螺旋韌帶和前庭膜、蓋膜，制成耳蝸標本,1%鋨酸后固定 1 h 后，0.1 mm/L磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)漂洗。將耳蝸標本放于2%單寧酸中浸2次，每次30 min，PBS漂洗3次，每次20 min。經(jīng)梯度乙醇脫水，臨界點干燥(EM CPD300，Leica公司，德國)。固定于鋼座上，經(jīng)離子濺射儀(E-1045，Hitachi公司，日本)鍍膜行掃描電鏡SEM-LV(NOVA NanoSEM 230，F(xiàn)ei公司，美國)觀察。

1.5 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行成組樣本的t檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察 4組左耳分別行不同功率激光鼓膜前下象限打孔，右耳對照組使用細針機械打孔，均使得穿孔直徑達0.5 mm。術后即刻在顯微鏡下見1、2 W組和3 W+生理鹽水組鼓膜穿孔邊緣光整，中耳鼓室和耳蝸未見明顯黑色炭化樣物。但是單純3 W激光造孔組，可見耳蝸鼓岬處黑色炭化明顯。術后第3天開始3 W激光組就開始有豚鼠死亡，至術后2周，3 W組豚鼠死亡3只，考慮可能術后炎癥反應較強，進食差或感染死亡。術后2周發(fā)現(xiàn)1 W組豚鼠1只、2 W組豚鼠2只、3 W組豚鼠2只和 3 W+生理鹽水組豚鼠2只中耳感染，中耳較多膿性分泌物，故給予排除計數(shù)。

2.2 穿孔愈合時間觀察 激光造孔后1周后電耳鏡下觀察每組雙側鼓膜愈合情況，因為之前預實驗觀察1周內(nèi)鼓膜穿孔均不會愈合，并記錄每組實驗組和對照組時間(表1)，其中4組實驗組與對照組愈合時間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明激光行鼓膜打孔比傳統(tǒng)的機械穿孔愈合時間稍長。

表1 激光照射后實驗組與對照組鼓膜穿孔愈合時間±s)

注：a表示各組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)

2.3 ABR測試 所有豚鼠于打孔前、打孔后即刻和2周后處死前行ABR測試(表2)。從表2中可見，激光打孔后即刻1 W組ABR閾移與對照組比較無明顯差異(P=0.78)，但是2、3 W組和3 W+生理鹽水組術后即刻ABR閾移與對照組比較有明顯差異(P<0.01)；激光打孔后2周觀察發(fā)現(xiàn)，1 W組和2 W組ABR閾值均基本回復到術前水平，與對照組比較無明顯差異(P值分別為0.7和0.2)，但是3 W組和 3 W+生理鹽水組閾移與對照組比較有差異(P<0.01)。雖然3 W+生理鹽水組閾值比術后即刻有所降低，但是仍然未回復到術前水平。

表2 激光鼓膜打孔前后各組豚鼠ABR閾移檢測

組別打孔后即刻閾移打孔后2周閾移1W組21.50±3.373.33±2.502W組32.00±3.5a5.00±3.783W組41.50±3.37a49.00±4.18b3W+生理鹽水組40.50±3.69a23.75±3.54b,c對照組20.50±3.693.00±2.58

注：a表示打孔后即刻ABR閾移與對照組比較有差異(P<0.01)；b表示打孔后2周ABR閾移與對照組比較有差異(P<0.01)；c表示改組術后2周閾移與術后即刻閾移有明顯差異(P<0.01)

2.4 掃描電鏡觀察 術后2周行ABR測試后斷頭處死豚鼠，取耳蝸做掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，3 W激光鼓膜打孔組，耳蝸底中回3排外毛細胞中均見部分靜纖毛脫落破壞，表皮板部分有裂開(圖1A)，內(nèi)毛細胞完整，且排列整齊。正常對照組、1 W組和2 W組(圖1B)，外毛細胞排列基本正常，未見明顯破壞和脫落。

圖1. 術后2周掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，3 W激光鼓膜打孔組，耳蝸底中回3排外毛細胞(白色箭頭)中均見部分靜纖毛脫落破壞，表皮板部分有裂開(A)，內(nèi)毛細胞完整排列整齊。正常對照組、1 W組和2 W組(B)，外毛細胞排列基本正常，未見明顯破壞和脫落。IHC為內(nèi)毛細胞，OHC1為第1排外毛細胞；OHC2為第2排外毛細胞；OHC3為第3排外毛細胞 ×5 000

3 討論

分泌性中耳炎是耳科常見病和多發(fā)病，尤其多見于兒童，傳導性聾和鼓室積液病程較長，在一定程度上影響著患兒的生活。一般認為與咽鼓管功能障礙、感染和自身免疫失調(diào)所致中耳分泌、吸收和排泄障礙引起中耳積液有關。既往有報道[1]指出，激光治療分泌性中耳炎具有操作簡單、時間短、傷口愈合慢、痛苦小、療效好等優(yōu)點，有較好的臨床應用價值。激光波長及其射線束特征提供了有效的能量來源，用于切割和消融含水量高的組織。最早在1995年開始報道鈥激光用于鼓膜照射引起的改變[2]，國內(nèi)外許多學者相繼使用CO2激光[3]行動物鼓膜手術，證明其安全性和有效性。

激光鼓膜打孔手術可以避免鼓膜置管和全身麻醉手術，因此值得推廣，尤其適合門診手術[4]。本實驗選用新型FiberLase CO2激光波導技術和AcuPulse波導(WG)激光系統(tǒng)，使得用小纖維、轉角、可彎曲手柄和纖維內(nèi)鏡直接照射組織成為可能。采用該光纖型CO2激光進行鼓膜打孔，提供了清晰的瞄準光束，可用于定位不可見的CO2激光能量，充分保障了手術安全。本實驗通過不同激光功率大小進行鼓膜打孔，了解該新型激光行鼓膜打孔的可行性和合適參數(shù)。實驗發(fā)現(xiàn)，在激光功率為1、2、3 W和3 W+生理鹽水組，鼓膜穿孔愈合時間均較對照組機械損傷組長。有研究[1]表明，如果激光打孔后鼓膜過早愈合而鼓室內(nèi)仍有積液者可以再次接受激光鼓膜造孔治療，手術較安全。造孔主要是利用激光熱效應減少穿孔邊緣的血供，延遲穿孔愈合。造孔直徑控制在2～4 mm，有利于中耳腔的通氣、引流，促進咽鼓管功能的恢復，療效較好，治愈率和好轉率達68.8%。

為探討新型FiberLase CO2激光鼓膜造孔的安全性，本實驗對于1、2、3 W組和3 W+生理鹽水組術前和術后即刻、術后2周均行ABR檢測聽覺功能的改變，發(fā)現(xiàn)鼓膜穿孔對于ABR是有影響的。1 W組術后即刻和對照組ABR閾移沒有明顯差異，本實驗中說明鼓膜穿孔一般影響ABR閾移在17～24 dB SPL，在2、3 W組和3 W+生理鹽水組術后即刻ABR閾移與對照組比較有差異，說明激光在術后即刻可能造成了輕微的內(nèi)耳損傷。我們選擇術后2周處死小鼠行聽力學和形態(tài)學檢查，主要是因為激光所造的穿孔愈合時間基本上在術后2周，所以檢查鼓膜愈合的各組豚鼠ABR閾值改變，發(fā)現(xiàn)1 W和2 W組閾值基本回復到術前水平，與對照組比較閾移無明顯差異；而3 W組和3 W+生理鹽水組閾值仍然沒有回復到術前水平，與對照組比較有明顯差異，說明內(nèi)耳有不可逆性損傷。3 W+生理鹽水組術后2周閾值較術后即刻有明顯改善(P<0.01),說明生理鹽水有明顯保護內(nèi)耳的作用。CO2激光是水溶性激光，適合用于含水豐富的組織和器官，不易穿透。另外在大功率3 W組術后有3只豚鼠死亡，主要原因考慮為激光功率過大，耳蝸損傷嚴重引起感染死亡可能。而在3 W+生理鹽水組未見死亡豚鼠，這也再次說明生理鹽水減少了激光的損傷，所以在分泌性中耳炎有鼓室積液中使用是比較安全的。結合掃描電鏡觀察耳蝸的毛細胞超微結構同時證明，3 W 激光功率對內(nèi)耳外毛細胞有一定的損傷作用，尤其在中底回外毛細胞，每層外毛細胞均可見靜纖毛部分或完全脫落、倒伏和表皮板裂開，與聽覺功能的改變基本一致。本實驗說明，使用合適功率密度如1 W(54.1 J/cm2)和2 W(108.2 J/cm2)的FiberLase CO2激光豚鼠鼓膜造孔是安全的。有報道[5]表明，豚鼠耳蝸對聲損傷的敏感度是人類的10倍以上，因此本實驗的激光劑量用于人類是很安全的。有報道[1]使用CO2激光鼓膜打孔功率一般為8～10W(連續(xù)脈沖)，臨床使用也是安全、有效的。

近幾年也有許多報道說明激光鼓膜造孔治療分泌性中耳炎有較高的復發(fā)率，有文獻[6-7]報道激光鼓膜打孔治療分泌性中耳炎的兒童有效率為40%～83%，其中有手術失敗，需要再次行鼓膜置管手術。這個結果的差異與手術選擇何種病例有很大關系。有報道[8]表明，如果單純激光打孔對于兒童雙側分泌性中耳炎效果不佳，不如傳統(tǒng)的全身麻醉下鼓膜置管手術；但是在需要重復置管的患兒可以考慮局部麻醉下激光打孔+鼓膜置管手術，可以減輕反復手術的風險；對于不嚴重的分泌性中耳炎的患兒局部麻醉下激光打孔或激光打孔+鼓膜置管手術比全身麻醉下鼓膜置管手術要創(chuàng)傷小。內(nèi)鏡下鼓膜置管手術安全性較高，臨床使用廣泛；但和傳統(tǒng)的顯微鏡下鼓膜置管相比都需要長期留置管在鼓膜上，易產(chǎn)生鼓膜瘢痕、鈣化和永久性穿孔可能，影響患者的生活質(zhì)量。CO2激光鼓膜打孔，可以清除內(nèi)耳積液，引起的永久性穿孔并發(fā)癥可能性小。另外激光照射可能會產(chǎn)生熱效應，促進受損細胞功能恢復，加快中耳上皮細胞代謝，促進黏液排出，中耳黏膜恢復效果好[9]。

綜上所述，激光治療分泌性中耳炎有以下優(yōu)點：①損傷小，可以反復進行，可以控制穿孔大小，沒有異物反應；②操作簡便，帶有可以彎曲操作的光纖，準確度高，患者可在局部麻醉下進行，兒童也可以耐受，門診可以完成；③手術時間短，一般1次激光脈沖即可造孔成功；④并發(fā)癥少，很少引起鼓膜鈣化和感音神經(jīng)性聾[1,7,10]。新型光纖FiberLase CO2激光用于豚鼠鼓膜打孔安全、可行，只要功率密度控制在合適范圍內(nèi)不會造成內(nèi)耳損傷。臨床應用于分泌性中耳炎的治療也是有理論根據(jù)的,值得推廣應用。

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(本文編輯 楊美琴)

Research of fiber-enabled CO2laser tympanostomy in guinea pigs

YANG Xiao-yu， REN Dong-dong

Department of Otorhinolaryngology， Eye Ear Nose and Throat Hospital of Fudan University， Shanghai 200031， China

REN Dong-dong, Email: dongdong_ren@163.com

Objective To explore the feasibility of fiber-enabled CO2laser tympanostomy in guinea pigs and its influence on the structure and function of inner ear. Methods Forty guinea pigs were randomly divided into four groups. Guinea pigs belonging to the first three groups were treated with laser power(1，2，3 W) respectively for the left ear, while the forth group received intratympanic saline injection before 3W laser power. Laser treatment caused perforation on anterior inferior of pars tensa membrane tympani. Circular perforation was caused by needle for the right ear in all groups as controls. Otoscopes examinations were performed to evaluate the healing time of perforation. Auditory brainstem response(ABR) were accessed preoperatively， immediately and 2 weeks postoperatively. Morphological changes of hair cells′ microstructure were observed by scanning electron microscopy(SEM) 2 weeks postoperatively. Results The healing time of perforation of CO2laser-caused perforation was longer than needle-caused perforation(P<0.01). In 3 W CO2laser treatment group, part of cochlea carbonized, ABR threshold increased irreversibly and stereocilia of outer hair cells collapsed and disoriented. With previous intratympanic saline injection, ABR threshold increased immediately after laser perforation, but got partial restoration in 2 weeks with minor inner ear damage. Conclusions The new fiber-enabled CO2laser is effective and safe for secretory otitis media with effusion if the total amount of energy is kept within the limits. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:185-188)

Laser； Tympanic membrane； Perforation； Cochlea； Guinea pigs

國家自然基金青年-面上連續(xù)資助項目(81370022)；國家自然基金青年基金項目(81000413)；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年人才培養(yǎng)計劃(XYQ2013084)

復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科 衛(wèi)生部聽覺醫(yī)學重點實驗室 上海 200031

任冬冬(Email：dongdong_ren@163.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.03.009

2015-01-14)