鄭 倩，宋冠華，張 斌

·論著·

葫蘆素B抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞增殖機(jī)制的初步研究

鄭 倩*，宋冠華，張 斌

目的 研究葫蘆素B對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響及其作用的分子機(jī)制。方法 通過MTT法檢測葫蘆素B對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀檢測葫蘆素B對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和生理水平上活性氧含量、線粒體膜電位的影響。Hoechst 33258染色檢測藥物處理前后細(xì)胞形態(tài)的變化。Westernblot檢測葫蘆素B處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h前后Bcl-2、Bax、p21、p53等蛋白合成的變化。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，葫蘆素B可時(shí)間與濃度依賴性地抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖；濃度依賴性地誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡、活性氧水平升高和線粒體膜去極化；在蛋白水平上，葫蘆素B能誘導(dǎo)凋亡抑制蛋白Bcl-2下調(diào)，促凋亡蛋白Bax、p21、p53上調(diào)。結(jié)論 葫蘆素B在體外能顯著抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖，這一影響可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、ROS積累、線粒體膜去極化及其相關(guān)蛋白表達(dá)變化來實(shí)現(xiàn)。

葫蘆素B；SH-SY5Y細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；活性氧

0 引言

葫蘆素是從葫蘆科植物中提取的一種四環(huán)三萜化合物，具有多種生物活性，如免疫、抗炎、抗菌作用，同時(shí)還具有抗腫瘤的效果。在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，不同葫蘆素之間有很大的差別。根據(jù)具有氧化功能的四環(huán)烷基骨架所在的位置不同，將葫蘆素分為12類，如B、D、E、K、I、L、Q等，葫蘆素B是含量最為豐富的一類，目前對(duì)其研究也有很多(主要為抗腫瘤方面的研究[1])。葫蘆素B具有很多生物活性，主要用于慢性肝炎的治療[2]。近年研究報(bào)道顯示，低濃度的葫蘆素B可對(duì)多種腫瘤細(xì)胞起到抑制作用，如白血病、黑色素瘤和喉癌等，而且葫蘆素B在不同腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制并不完全相同[3-5]。目前，國內(nèi)外對(duì)于葫蘆素在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的毒性及其內(nèi)在機(jī)制的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過檢測葫蘆素B對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞增殖、凋亡、活性氧含量、線粒體膜電位及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，從生理與分子細(xì)胞水平上研究葫蘆素B對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的影響及其內(nèi)在機(jī)制，為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療提供新的思路。

1 材料

1.1 試劑 葫蘆素B(CucurbitacinB，CuB，98%)購自成都曼斯特生物技術(shù)公司，胰酶消化液、BCA蛋白濃度測定試劑盒以及活性氧、線粒體膜電位檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所，DMEM高糖液體培養(yǎng)基和無支原體胎牛血清購自HyClone公司，MTT和DMSO購于美國Sigma公司。Annexin-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，β-actin、Bcl-2、Bax、p53和p21等多克隆抗體購于Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠二抗購于武漢博士德生物工程公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系分別購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。用含10%無支原體胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 細(xì)胞增殖測定 向96孔板中接種2×104個(gè)/孔的對(duì)數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，去除舊培養(yǎng)基，加入含有不同濃度葫蘆素B的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，孵育4 h，棄上清，每孔加入100 μL DMSO，繼續(xù)37 ℃暗培養(yǎng)15 min后，570 nm下測定每孔的OD值。每孔設(shè)4個(gè)復(fù)孔，并以完全培養(yǎng)基為空白對(duì)照。細(xì)胞增殖率=對(duì)照組吸光值/處理組吸光值×100%。

2.2 細(xì)胞凋亡檢測 向6孔板中接種2×105個(gè)/孔的對(duì)數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞，葫蘆素B處理24 h后，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，去上清，每個(gè)樣品加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI，混勻后室溫下避光孵育15 min，盡快進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%。

2.3 Hoechst 33258檢測細(xì)胞形態(tài)變化 取6孔板中貼壁的SH-SY5Y細(xì)胞分別于含有DMSO和8 μM葫蘆素B的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，然后用倒置光學(xué)顯微鏡觀察處理前后細(xì)胞形態(tài)的變化。移除舊培養(yǎng)基，PBS洗細(xì)胞2次，然后加入Hoechst 33258染色液避光孵育3～5 min，最后吸出染色液，PBS洗2～3次，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

2.4 活性氧水平測定 葫蘆素B處理24 h后的SH-SY5Y細(xì)胞收集于離心管中，PBS洗滌2次，去上清后加入100 μL DCFH-DA探針，37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min，每隔3 min顛倒混勻1次，PBS洗滌后，加入300 μL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。

2.5 線粒體膜電位水平檢測 葫蘆素B處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，離心收集細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞2次，加入500 μL JC-1染色工作液重懸，37 ℃孵育20 min。待孵育結(jié)束后用JC-1染色緩沖液洗細(xì)胞2次后，再用500 μL JC-1染色緩沖液重懸細(xì)胞，最后流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。

2.6 蛋白免疫印跡 葫蘆素B處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，離心收集并裂解細(xì)胞提取蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線按每孔40 μg蛋白計(jì)算蛋白上樣量。15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后濕法轉(zhuǎn)膜，封閉液4 ℃封閉過夜，洗膜后分別以1∶200和1∶500比例加入特定抗體進(jìn)行一抗和二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜后，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白表達(dá)情況。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 葫蘆素B對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測不同濃度葫蘆素B處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h和48 h后細(xì)胞增殖的影響，見圖1。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，經(jīng)過葫蘆素B處理后，與對(duì)照組比較，SH-SY5Y細(xì)胞增殖率呈濃度、時(shí)間依賴性下降，且從8 μM濃度開始下降更顯著。

圖1 葫蘆素B處理SH-SY5Y細(xì)胞后增殖率的變化

3.2 葫蘆素B對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響 葫蘆素B處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯升高，且隨著藥物濃度的上升，細(xì)胞凋亡的比例上升。見圖2。

3.3 葫蘆素B對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響 經(jīng)過葫蘆素B處理后，細(xì)胞發(fā)生變圓、皺縮、體積變小等現(xiàn)象，經(jīng)過Hoechst 33258染色后，在視野內(nèi)可以觀察到致密濃染的細(xì)胞，有較強(qiáng)的藍(lán)色熒光，而正常細(xì)胞則呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色，且比葫蘆素B處理過的細(xì)胞數(shù)目多。見圖3。

3.4 葫蘆素B對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性氧水平的影響 見圖4。由圖4可見，葫蘆素B處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較，活性氧水平明顯升高，且在藥物濃度高于8 μM時(shí)，活性氧水平增加明顯，且呈現(xiàn)劑量依賴性上升趨勢。

圖2 葫蘆素B處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡率的變化

圖3 Hoechst 33258熒光染色結(jié)果

圖4 葫蘆素B處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后ROS水平的變化

3.5 葫蘆素B對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位的影響 葫蘆素B處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，細(xì)胞線粒體膜電位檢測結(jié)果如圖5所示，經(jīng)過葫蘆素B處理后，線粒體膜電位出現(xiàn)明顯的去極化現(xiàn)象，且隨著藥物處理濃度的增加，細(xì)胞去極化的水平也在不斷上升。

3.6 葫蘆素B對(duì)與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 不同濃度葫蘆素B處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax、p53、p21蛋白表達(dá)結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，葫蘆素B能夠分別誘導(dǎo)抗凋亡的Bcl-2下調(diào)、促凋亡的Bax上調(diào)，另外，葫蘆素B還能誘導(dǎo)與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的p53、p21上調(diào)。

圖5 葫蘆素B處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后線粒體膜電位的變化

圖6 葫蘆素B處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后蛋白表達(dá)的變化

4 討論

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma，NB)是兒童最常見的顱外惡性實(shí)體腫瘤，起源于神經(jīng)外胚層細(xì)胞，發(fā)生于腎上腺髓質(zhì)和交感神經(jīng)系統(tǒng)，具有生物行為多樣性的特點(diǎn)[6-7]。NB可自然消退，可轉(zhuǎn)為良性，但大部分腫瘤快速發(fā)展而導(dǎo)致患兒死亡[8-9]。神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療主要包括手術(shù)、化療、放療和生物治療，目前，化療在NB的治療中仍起重要作用，但由于化療給患者帶來痛苦和不良反應(yīng)等，研究者一直在探索新的、有效的治療方案。而中草藥、植物藥等天然產(chǎn)物中存在廣泛的生物活性物質(zhì)，從中草藥、植物中篩選毒副作用小、作用獨(dú)特的抗腫瘤藥物成分，研究其抗癌機(jī)制，開發(fā)高效抗癌藥物，具有重要意義。腫瘤發(fā)生的特點(diǎn)之一是細(xì)胞的惡性增殖，尋找能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡且對(duì)正常細(xì)胞毒副作用小的藥物是促進(jìn)研究開發(fā)抗癌藥物的新途徑。本試驗(yàn)中，葫蘆素B作為從常見的葫蘆科植物中提取的一種化學(xué)成分，能夠表現(xiàn)出抑制神經(jīng)腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的作用，為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療和藥物開發(fā)提供理論參考。

細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生有多種途徑，本實(shí)驗(yàn)通過MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot等方法從生理到分子水平檢測了葫蘆素B處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞后各方面的變化。結(jié)果顯示，葫蘆素B能夠濃度依賴性地誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞早期凋亡。細(xì)胞凋亡往往伴隨著一系列形態(tài)上的改變，通過Hoechst 33258染色后細(xì)胞核呈現(xiàn)致密濃染，進(jìn)一步證明了細(xì)胞在經(jīng)過葫蘆素B處理后出現(xiàn)了凋亡的形態(tài)學(xué)特征。ROS積累、線粒體膜電位下降都能促使細(xì)胞啟動(dòng)凋亡機(jī)制，而這兩種生理變化之間又存在密切聯(lián)系。近年研究表明，部分抗癌藥物能夠通過引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-11]。細(xì)胞內(nèi)ROS主要來源于線粒體細(xì)胞器，產(chǎn)生于線粒體呼吸鏈[12]，在呼吸鏈的電子傳遞過程中，大約有2%～5%的離子發(fā)生逃逸釋放出超氧離子，增加細(xì)胞的氧化損傷。ROS還能通過誘導(dǎo)DNA突變數(shù)目的增加、降低基因組穩(wěn)定性、氧化膜質(zhì)或直接激活與凋亡相關(guān)的基因或蛋白的表達(dá)等方式來促使細(xì)胞凋亡發(fā)生，且神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞對(duì)ROS水平變化更為敏感，從而更容易發(fā)生凋亡現(xiàn)象。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，葫蘆素B能夠引起SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，進(jìn)一步證明了葫蘆素B具有誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡的作用。線粒體跨膜電位的形成依賴于線粒體呼吸鏈中產(chǎn)生的跨膜質(zhì)子梯度?？缒る娢坏木S持與線粒體膜的完整性密不可分。在細(xì)胞凋亡過程中，線粒體膜通透性改變，一些離子的內(nèi)流導(dǎo)致膜內(nèi)外電位發(fā)生改變，從而造成線粒體膜電位下降，出現(xiàn)去極化現(xiàn)象。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族成員，分別具有抗凋亡和促凋亡的作用，二者在細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮重要作用。有報(bào)道，Bcl-2和Bax是線粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白，Bcl-2位于線粒體外膜，能夠阻止細(xì)胞色素C的釋放，而Bax最開始則處于無活性狀態(tài)，只有當(dāng)其進(jìn)入線粒體之后才轉(zhuǎn)化為激活的形式來促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抗凋亡的Bcl-2和促凋亡的Bax的蛋白量比對(duì)細(xì)胞的凋亡信號(hào)有一定的敏感性，Bcl-2/Bax比例下降可能是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵[13]。本試驗(yàn)中，葫蘆素B處理之后能夠使Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致Bcl-2/Bax比例下降。p53和p21能夠抑制Bcl-2和CIAPs蛋白活性，激活促凋亡蛋白活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究在細(xì)胞與分子水平上檢測了葫蘆素B對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的影響，表明葫蘆素B能夠劑量依賴性地抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，說明葫蘆素B具有一定的抗癌潛力和研發(fā)前景，對(duì)研究和治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤具有重要的理論意義。

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Preliminary study on the inhibitory effect of cucurbitacin B on the proliferation of SH-SY5Y cells

ZHENG Qian*,SONG Guan-hua,ZHANG Bin

(Department of Life Science,Huizhou University,Huizhou 516007,China)

Objective To study the effect of cucurbitacin B on the proliferation of SH-SY5Y cells,and to clarify the molecular mechanism.Methods MTT assay was used to test the effect of cucurbitacin B on proliferation of SH-SY5Y cells. Apoptosis,ROS production and mitochondrial membrane potential of SH-SY5Y cells were detected by flow cytometry. Morphological changes of cells with or without drug treated were observed by Hoechst 33258 staining. The protein expression of Bcl-2,Bax,p21 and p53 was investigated by western blot. Results In the range of experimental dose,cucurbitacin B inhibited the proliferation of SH-SY5Y cells in dose-dependent and time-dependent manners,and also induced cell apoptosis,promoted ROS production,depolarized mitochondrial membrane potential in SH-SY5Y cells. In the protein level,the decreasing protein expression of Bcl-2,increasing protein expression of Bax,p21 and p53 were also observed in SH-SY5Y cells after cucurbitacin B treatment. Conclusion Cucurbitacin B inhibits the proliferation of SH-SY5Y cells significantly by inducing cell apoptosis,changing the physiological level and regulating the protein expressions of Bcl-2,Bax,p53 and p21.

Cucurbitacin B;SH-SY5Y cell;Cell apoptosis;ROS

2014-12-05

惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東 惠州516007

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201507001