熊 琳，朱 軍，李 鵬，陳琴華*

·藥學研究·

1,1,6-三甲基-4,6-二氮螺[2.4]庚烷-5,7-二酮抗癲疒間藥理活性研究

熊 琳1,2，朱 軍1,2，李 鵬1,2，陳琴華1,2*

目的 從合成的大量化合物中篩選抗驚厥活性比較好的化合物，為新型抗癲疒間藥物的開發(fā)提供依據(jù)。方法 以乙內(nèi)酰脲類化合物為母核，對其化學結(jié)構(gòu)進行改造優(yōu)化，合成1,1,6-三甲基-4,6-二氮螺[2.4]庚烷-5,7-二酮(MPVM)。采用最大電休克驚厥實驗(MES)、皮下注射戊四氮(PTZ)實驗、最大電休克驚厥閾值實驗、戊四氮(ipPTZ)閾值實驗評價MVPM化合物的抗驚厥活性。結(jié)果 MVPM化合物抗MES、PTZ的ED50分別為14.7、41.7 mg/kg。MVPM化合物可提高小鼠最大電驚厥發(fā)作閾值，提高小鼠驚厥的耐受性，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)論 該化合物抗癲疒間活性好，具有進一步研究開發(fā)的價值。

1,1,6-三甲基-4,6-二氮螺[2.4]庚烷-5,7-二酮；抗癲疒間；藥理活性；MES；PTZ

0 引言

癲疒間是神經(jīng)混亂疾病中比較常見的一種，在世界范圍內(nèi)，約有5 000多萬例患者，發(fā)病率與很多疾病相比較高(約0.5%～1.0%)，死亡率約為1.0%～3.0%。雖然目前已經(jīng)有許多治療效果較好的抗癲疒間藥物，仍然有大部分癲疒間患者的病情不能得到有效的控制。

乙內(nèi)酰脲類衍生物具有多種藥理活性，如抗驚厥作用、抑制血小板凝聚、抗心律失常、抗病毒、拮抗細胞黏連等。本課題組一直致力于乙內(nèi)酰脲衍生物的合成和藥理活性的研究，從已經(jīng)合成的大量化合物中篩選出抗驚厥活性比較好的化合物[1-2]，本試驗就化合物1,1,6-三甲基-4,6-二氮螺[2.4]庚烷-5,7-二酮(MPVM)作為抗癲疒間藥物的研究與開發(fā)價值進行初步成藥性研究，得到該化合物的初步評價。

目前，在抗癲疒間藥物篩選過程中，通常采用三種模型，包括最大電驚厥(MES)、戊四氮誘導的發(fā)作模型(PTZ)以及點燃模型(Kindling model)。這些模型可以在小鼠、大鼠、狗、猴子等動物體內(nèi)建立。在這些篩選模型中，研究新的抗癲疒間藥物普遍采用的是MES和皮下注射PTZ(scPTZ)發(fā)作模型[3-5]。MES和scPTZ模型用于篩選抗驚厥藥物的優(yōu)點較多。首先，這兩種模型容易操作，可以大量篩選，需要的設備投資最小，技術含量要求不高；此外，通過這兩種方法獲得的數(shù)據(jù)比較有價值，能夠作為抗驚厥化合物的評判依據(jù)。在目前上市的抗癲疒間藥物中，除了乙拉西坦(LEV)[6-7]，其他藥物在這兩種模型至少有一種是具有活性的。

1 合成試驗

1.1 儀器與試藥 RE-5298型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器廠)，GF-254硅膠(青島海洋化工廠)，XT-4型顯微熔點測定儀(上海濟成分析儀器有限公司)，其他試劑均為國藥化學純(CP)或分析純(AR)。

1.2 方法 合成路線：見圖1。具體合成方法參考文獻[2]。

圖1 合成路線圖

2 藥理試驗

2.1 材料 YSD-4G型藥理生理實驗多用儀(安徽正華生物儀器設備有限公司)。電子天平，小鼠鼠籠、灌胃針頭、注射針頭，1 mL注射器若干。SPF級昆明小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，由武漢大學動物實驗中心提供。實驗前1周飼養(yǎng)于鼠籠中，自由進食和純凈水。飼養(yǎng)條件為自由光照，溫度(23±3)℃，相對濕度55%±5%。1周的試驗條件飼養(yǎng)之后，小鼠根據(jù)試驗所需只數(shù)隨機分組，每只小鼠只用1次且所有的試驗在8∶00～16∶00進行。

2.2 方法 抗癲疒間藥理試驗采用美國國立衛(wèi)生院公布的抗癲疒間藥物開發(fā)程序[8-9]先進行Ⅰ期藥理試驗，結(jié)果表明，該化合物具有較好的藥理活性[10]，具有開發(fā)價值，可以進行下一步試驗，為臨床試驗提供更為具體可靠的信息。本試驗采用4種藥理模型，最大電休克驚厥實驗(MES)、皮下注射戊四氮(PTZ)實驗、最大電休克驚厥閾值實驗、戊四氮(ipPTZ)閾值實驗評價MVPM化合物的抗驚厥活性。

2.2.1 最大電休克驚厥實驗(MES) 在實驗的前1 d使用YSD-4GA藥理生理實驗多用儀對飼養(yǎng)1周的小鼠進行篩選，篩選條件：50 mA，60 Hz，0.2 s。先將小鼠的兩耳涂上一定量的注射用生理鹽水，以保證鼠耳有良好的導電性能。用耳緣電極夾住小鼠兩側(cè)耳尖部即可通電，給予電刺激篩選出出現(xiàn)后肢強直的合格小鼠，即可用于下一步的活性測定實驗。

實驗步驟：取實驗前1 d篩選合格的昆明小鼠，隨機分成5組，每組10只，雄雌各半。按照預試驗結(jié)果，設計梯度濃度，分別給予不同劑量的化合物，每組均采用腹腔注射給藥。給藥1 h后使用YSD-4GA藥理生理實驗多用儀在相同條件下給予小鼠電刺激，觀察記錄小鼠電刺激之后的實驗行為。MPVM在該劑量下是否具有抗驚厥活性取決于小鼠的行為，若小鼠出現(xiàn)后肢強直則此劑量下無效，反之則有效。見表1。

表1 MPVM對抗小鼠MES驚厥ED50實驗結(jié)果(n=10)

注：MESa，最大電驚厥

2.2.2 皮下注射戊四氮(PTZ)實驗 實驗小鼠(雌雄各半)隨機分為空白組、受試MPVM組，每組10只。空白組注射等量溶媒，受試MPVM組腹腔注射化合物，1 h后，每組小鼠皮下注射85 mg/kg戊四氮。每組小鼠按照雌雄分別放于2個鼠籠中觀察0.5 h。分別記錄每組小鼠的行為情況，包括陣攣、強直和死亡的個數(shù)。

表2 MPVM對抗小鼠PTZ誘導驚厥ED50實驗結(jié)果(n=10)

2.2.3 最大電休克驚厥閾值實驗 為了評估最大電驚厥閾值，將小鼠隨機分為4組，每組10只，用不同強度的電刺激，篩選10%～30%、30%～50%、50%～70%和70%～90%的發(fā)作小鼠。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，計算出半數(shù)電流強度(CS50/mA)。

實驗步驟：①空白對照：取40只SPF級昆明小鼠，隨機分為4組，每組10只。每只小鼠用藥前自身作為空白對照，小鼠腹腔注射一定量的溶媒，1 h后給予電刺激，根據(jù)小鼠的反應改變電流強度，記錄小鼠驚厥發(fā)作閾值(CS50，mA)。②給MPVM后發(fā)作閾值實驗：小鼠電驚厥后，至少隔48 h后才能進行第2次電驚厥實驗。小鼠腹腔注射受試MPVM不同劑量。1 h后給予電刺激，觀察并記錄小鼠出現(xiàn)驚厥的電流強度，記錄給藥后小鼠發(fā)作閾值(CS50)，實驗結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度MPVM對MES閾值改變(n=10)

2.2.4 戊四氮(ipPTZ)閾值實驗 為了評價藥物抗驚厥的活性，采用腹腔注射PTZ判斷化合物對于提高機體對驚厥耐受性的指標。該模型能夠評價一個藥物調(diào)整發(fā)作閾值的效果。首先給小鼠一定劑量的化合物，然后腹腔注射不同劑量的PTZ，觀察小鼠的發(fā)作閾值。

實驗步驟：實驗小鼠隨機分為空白組、受試化合物MPVM組、對照品卡馬西平組，每組按照表3中PTZ劑量分組，每組8只?？瞻捉M小鼠腹腔注射溶媒，受試MPVM組腹腔注射MPVM劑量為50 mg/kg，卡馬西平組腹腔注射卡馬西平劑量為100 mg/kg。1 h后開始腹腔注射PTZ，之后，小鼠可以在鼠籠自由活動以免影響觀察閾值。觀察30 min并記錄小鼠的行為，以出現(xiàn)全身陣攣為觀察指標。

表3 MPVM PTZ誘導癲疒間閾值發(fā)作實驗結(jié)果(n=8)

3 討論

MES試驗中，MPVM的ED50為14.7 mg/kg，其半數(shù)有效量小于臨床上常用的苯妥英，活性與苯巴比妥相當，強于丙戊酸鈉。PTZ試驗中，MPVM在PTZ誘導驚厥試驗模型中的ED50為41.7 mg/kg；在PTZ誘導的癲疒間模型中，能夠顯著提高小鼠的癲疒間閾值，延長小鼠癲疒間發(fā)作潛伏期，雖然其對小鼠癲疒間發(fā)作死亡保護不及卡馬西平，但其有效劑量遠遠低于卡馬西平。MES閾值試驗中，MPVM能夠提高小鼠最大電驚厥發(fā)作閾值，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。MPVM在腹腔注射25 mg/kg 1 h后，能夠顯著提高小鼠的電驚厥閾值：由6.7 mA提高到9.5 mA。PTZ閾值試驗中，MPVM能夠影響PTZ誘導的小鼠驚厥，與卡馬西平相比，能夠顯著提高小鼠驚厥的耐受性，使得在此模型中小鼠CD50為75.3 mg/kg，而卡馬西平為66.9 mg/kg。

抗癲疒間的動物模型種類較多，如：①局部運用γ-氨基丁酸受體拮抗劑(青霉素、木防己苦毒素等)；②點燃致驚模型；③化學點燃模型(海人酸、戊四氮等)；④MES和scPTZ模型。由于本實驗室條件有限、一些藥物是管制品難以購買及實驗技術限制，使得MPVM作為抗癲疒間藥物的藥理活性評估所用模型較少。未來應進行更大規(guī)模、更多藥理模型的試驗。

Antiepileptic pharmacological activity of 1,1,6-trimethyl-4,6-diaza-spiro[2.4] heptan-5,7-dione

XIONG Lin1,2,ZHU Jun1,2,LI Peng1,2,CHEN Qin-hua1,2*

(1.Department of Pharmacy,Affiliated Dongfeng Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442008,China;2.Institute of Pharmaceutical Analysis and Drug Screening,Hubei University of Medicine,Shiyan 442008,China)

Objective To survey the pharmacological action of 1,1,6-trimethyl-4,6-diaza-spiro [2.4] heptan-5,7-dione.Methods The chemical structure of hydantoin was modified to obtain analogs-1,1,6-trimethyl-4,6-diaza-spiro [2.4] heptan-5,7-dione(MPVM) and examine the anticonvulsant activities of MPVM by MES test,PTZ test,electroconvulsive threshold test,PTZ-evoked seizure test.Results MVPM antagonized MES(ED50=14.7 mg/kg)and PTZ(ED50=41.7 mg/kg).MVPM could also raise mice′s electroconvulsive threshold and PTZ-evoked seizure threshold.Conclusion The compound has a good antiepileptic activity,it deserves for a further research with good development.

1,1,6-trimethyl-4,6-diaza-spiro [2.4] heptan-5,7-dione;Atiepileptic;Parmacological activity;MES;PTZ

2014-12-18

1.湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院藥學部，湖北 十堰 442008；2.湖北醫(yī)藥學院藥物分析與篩選研究所，湖北 十堰 442008

湖北省衛(wèi)生廳青年科技人才項目(QJX2012-45)

10.14053/j.cnki.ppcr.201507015

*通信作者