王文蘭，付彩文，付文浩，柳樹芳，王姝蓮，程三芳

冬凌草甲素對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制

王文蘭1a，付彩文2，付文浩1a，柳樹芳1a，王姝蓮1a，程三芳1b

目的 探討冬凌草甲素對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用及其作用機(jī)制。方法 以10、20、40 μmol/L不同濃度冬凌草甲素(Ori)作用于胰腺癌SW1990細(xì)胞，采用CCK-8檢測(cè)胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡情況；RT-PCR法檢測(cè)Survivin、p21基因mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 不同濃度的Ori作用于胰腺癌SW1990細(xì)胞1、2、3 d后，胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖抑制程度不等，藥物濃度越高，抑制程度越高，兩者間具有明顯劑量與時(shí)間依賴性。0、10、20、40 μmol/L的冬凌草甲素作用于胰腺癌SW1990細(xì)胞24 h后，凋亡率分別為0.87%±0.65%、1.85%±1.02%、5.38%±0.15%和16.60%±0.50%，出現(xiàn)明顯的G2/M期周期阻滯。與對(duì)照組相比，10、20、40 μmol/L的Ori作用于SW1990細(xì)胞24 h后，p21 mRNA表達(dá)增加，而Survivin mRNA表達(dá)下降。結(jié)論 冬凌草甲素通過誘導(dǎo)凋亡和G2/M期周期阻滯來實(shí)現(xiàn)對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用，其機(jī)制可能與Survivin和p21調(diào)節(jié)信號(hào)有關(guān)。

冬凌草甲素；胰腺癌；SW1990細(xì)胞；增殖抑制

0 引言

胰腺癌作為一種預(yù)后較差的惡性腫瘤，近年來的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，具有極低的5年生存率和治愈率[1]。細(xì)胞凋亡的急劇減少在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展以及對(duì)放化療的耐受情況起重要作用。冬凌草甲素(Oridoni，Ori)作為一種從唇形科植物香菜屬植物提取的重要活性二萜成分，具有抗炎、抑菌以及抗腫瘤等的藥理作用，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[2]。人胰腺癌SW1990細(xì)胞是分子生物學(xué)意義上的胰腺癌標(biāo)志性細(xì)胞，在胰腺癌臨床診斷中具有重要意義[3]。本研究針對(duì)Ori對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用及其作用機(jī)制進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物和細(xì)胞株 Ori購自湖北巨勝科技有限公司(純度在98%以上)；胰腺癌SW1990細(xì)胞株來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。根據(jù)Ori的濃度不同分為0(對(duì)照組)、10、20、40 μmol/L濃度組。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8檢測(cè)胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖情況 將處于對(duì)數(shù)生長期的人胰腺癌SW1990細(xì)胞種植到96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為5×103，細(xì)胞貼壁后將不同濃度的Ori(0、10、20、40 μmol/L)分別加入到孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，并將加入0.1%的DMEM培養(yǎng)基液的細(xì)胞作為對(duì)照組，分別培養(yǎng)1、2、3 d。在藥物作用結(jié)束前1 h，在每個(gè)孔中加入0.01 mL的CCK-8后繼續(xù)培養(yǎng)1 h，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組)×100%。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡情況 采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡情況。將處于對(duì)數(shù)生長期的人胰腺癌SW1990細(xì)胞種植到6孔板中，每孔的細(xì)胞數(shù)量為4×105，細(xì)胞生長至90%融合時(shí)，每孔中加入40 μmol/L的Ori，1 d后收集細(xì)胞，使用胰蛋白酶進(jìn)行消化后，以1 000 r/min的速度離心5 min。冷PBS洗2次，并用0.5 mL的PBS重懸細(xì)胞加入到RNA酶中，使?jié)舛茸優(yōu)?00 μg/L，置37 ℃水浴中0.5 h，加入5 μL PI進(jìn)行混勻后15 min上機(jī)檢測(cè)，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，結(jié)果采用Cellquest軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)Survivin、p21基因mRNA表達(dá)水平 將處于對(duì)數(shù)生長期的人胰腺癌SW1990細(xì)胞采用不同濃度的Ori(0、10、20、40 μmol/L)進(jìn)行處理后加入TRIzol 1 mL抽提細(xì)胞RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒上的操作說明合成cDNA，采用GeneAmp9600型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。Survivin以及p21基因mRNA的反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 4 min，變性94 ℃ 30 s，退火54 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，最后延伸10 min，一共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物置于1.5%的瓊脂凝膠電泳中進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo) CCK-8檢測(cè)胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡情況；RT-PCR法檢測(cè)Survivin、p21基因mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測(cè)Ori對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖抑制作用 不同濃度的Ori作用于胰腺癌SW1990細(xì)胞1、2、3 d后，胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖抑制程度不等，藥物濃度越高，抑制程度越高，兩者間具有明顯劑量與時(shí)間依賴性。見圖1。

圖1 不同濃度的Ori對(duì)胰腺癌SW1990增殖的抑制作用

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡情況 0、10、20、40 μmol/L的Ori作用于胰腺癌SW1990細(xì)胞24 h后，凋亡率分別為0.87±0.65、1.85±1.02、5.38±0.15和16.60±0.50，出現(xiàn)明顯的G2/M期周期阻滯。見表1。

表1 不同濃度Ori作用于SW1990細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡情況

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 不同濃度Ori作用于SW1990細(xì)胞24 h后，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，10、20、40 μmol/L的Ori作用于SW1990細(xì)胞24 h后，p21 mRNA表達(dá)增加，而Survivin mRNA表達(dá)下降，具體見圖2、圖3。

3 討論

胰腺癌作為臨床惡性程度較高的腫瘤類型之一，其腫瘤在生長過程中無特異性表現(xiàn)，具有早期臨床癥狀隱匿的特點(diǎn)，極易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，大多數(shù)胰腺癌在確診時(shí)已屬晚期[4]。傳統(tǒng)的放射和手術(shù)治療對(duì)這種侵襲性的腫瘤進(jìn)展療效甚微，只有對(duì)胰腺癌的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行深入的研究才能尋找出一種有效的靶點(diǎn)進(jìn)行早期診斷和治療。Survivin基因是目前為止抗凋亡活性最強(qiáng)的抗凋亡基因，幾乎在所有惡性腫瘤中都具有較高的表達(dá)水平，但在正常組織中則檢測(cè)不到[5]。

圖2 流式細(xì)胞儀分析的Ori處理24 h SW1990細(xì)胞的DNA直方圖

圖3 RT-PCR檢測(cè)在SW1990細(xì)胞中p21 mRNA、Survivin mRNA的表達(dá)情況

Ori作為一種從唇形科植物香菜屬植物提取的重要活性二萜成分，其主要的植物來源為香茶菜、毛葉香茶菜以及冬凌草等植物[6]。Ding等[7]研究顯示，Ori對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有明顯的抑制作用，通過誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行程序性死亡以達(dá)到調(diào)節(jié)生物體細(xì)胞群數(shù)目相對(duì)穩(wěn)定的目的，而幾乎所有的抗腫瘤藥物都是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來達(dá)到其抗腫瘤目的。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的Ori作用于胰腺癌SW1990細(xì)胞1、2、3 d后，胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖抑制程度不等，藥物濃度越高，抑制程度越高，兩者間具有明顯劑量與時(shí)間依賴性。證實(shí)Ori可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。劉軍樓等[8]研究顯示，Survivin基因具有調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂以及抑制細(xì)胞凋亡的雙重功能，這是由于Survivin基因在G2/M時(shí)期呈特異性表達(dá)，是G2/M的調(diào)節(jié)因子，此時(shí)Survivin與紡錘體的微管進(jìn)行特異性結(jié)合，從而維持細(xì)胞有絲分裂的正常進(jìn)行。Bu等[9]研究顯示，G2/M期調(diào)控點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)進(jìn)行傳遞、整合與收集的重要調(diào)控點(diǎn)，通過將這些信號(hào)收集到細(xì)胞核從而對(duì)細(xì)胞的增殖進(jìn)行調(diào)控。細(xì)胞增殖的G2/M期是RNA合成染色質(zhì)螺旋化的時(shí)期，此時(shí)細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境的影響較為敏感，也是進(jìn)行腫瘤放化療最敏感的時(shí)期[10]。另外，Ori通過抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞的生長從而發(fā)生細(xì)胞凋亡，還可以提升三氧化二砷及伊馬替尼等化療藥物的促凋亡作用。本研究中，通過將10、20、40 μmol/L的Ori作用于胰腺癌SW1990細(xì)胞，出現(xiàn)明顯的G2/M期周期阻滯。證實(shí)細(xì)胞周期阻滯是Ori抑制胰腺癌細(xì)胞的主要機(jī)制，且Ori可以降低人胰腺癌SW1990細(xì)胞中Survivin mRNA的表達(dá)，從而解除對(duì)Caspase-3的抑制作用，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[11]。p21作為一種廣譜的周期依賴性蛋白激酶，可以與細(xì)胞周期蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地與周期素依賴的蛋白結(jié)合，從而抑制該酶活性，降低對(duì)靶蛋白發(fā)揮磷酸化作用的能力。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，10、20、40 μmol/L的Ori作用于SW1990細(xì)胞24 h后，p21 mRNA表達(dá)增加，而Survivin mRNA表達(dá)下降。從而證實(shí)Ori通過使Survivin mRNA表達(dá)下降以及p21 mRNA表達(dá)增加等方式來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡以及周期阻滯，從而抑制人胰腺癌SW1990細(xì)胞的增殖，且呈時(shí)間劑量依賴。

綜上所述，Ori可以明顯抑制人胰腺癌SW1990細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)凋亡和G2/M期周期阻滯來實(shí)現(xiàn)對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用，其機(jī)制與Survivin和p21調(diào)節(jié)信號(hào)有關(guān)。

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Inhibiting effect of oridonin on human pancreatic cancer cell line SW1990 and its mechanism

WANG Wen-lan1a，F(xiàn)U Cai-wen2，F(xiàn)U Wen-hao1a，LIU Shu-fang1a，WANG Shu-lian1a，CHENG San-fang1b

(1.a.The Second Department of Internal Medicine,b.Department of Pharmacy,Shexian County Hospital of Traditional Chinese Medicine,Handan 056400,China; 2.Department of Radiology,Shexian County Hospital,Handan 056400,China)

Objective To investigate the inhibit effect of oridonin on human pancreatic cancer cell line SW1990 and its mechanism.Methods SW1990 cells were induced with different concentrations (10,20,40 μmol/L) of oridonin,the proliferation of SW1990 cells were detected by CCK-8; cell cycle and apoptosis were measured by flow cytometry; RT-PCR assay was used to detect the expression level of survivin and p21 gene mRNA.Results Different concentrations of oridonin inhibited SW1990 cells proliferation in a time-and dose-dependent manner after 1d,2 d,3 d.Oridonin at 0,10,20,40 μmol/L caused obvious cell cycle arrest in G2/M phase,and 24 h apoptosis rate were 0.87%±0.65%、1.85%±1.02%,5.38%±0.15% and 16.60%±0.50%.Compared with control group,p21 mRNA expression increased,while Survivin mRNA expression decreased.Conclusion Oridonin inhibits SW1990 cells proliferation by inducing apoptosis and arresting G2/M phase cycle,which may be related to Survivin and p21 regulatory signals.

Oridonin; Pancreatic cancer; SW1990 cells; Inhibition of proliferation

2014-10-29

1.涉縣中醫(yī)院a.內(nèi)二科，b.藥劑科，河北 邯鄲 056400；2.涉縣醫(yī)院放射科，河北 邯鄲 056400

河北省中醫(yī)藥管理局科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃(2008056)

10.14053/j.cnki.ppcr.201507003