曹 冬 梅，倪 長 鵬，劉 宇，盧 熠 川，許 龍 巖，曹 際 娟

（1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001；2.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；3.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 廣州 510623）

0 引 言

沙門菌屬菌型甚多，目前在全世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)2 500余種血清型，我國也有292種被檢出的報(bào)道［1］。腸炎沙門菌（SalmonellaEnteritidis，SE）是腸道沙門菌的一種主要血清型，由于其致病性強(qiáng)、感染對象廣泛等特點(diǎn)，引起了各國學(xué)者的廣泛關(guān)注［2－5］。1996年，我國向歐洲出口的兔肉中檢測出了腸炎沙氏菌，直接導(dǎo)致?lián)p失3 000多萬元［2］。2010年，美國加利福尼亞州腸炎沙門菌疫情肆虐，染病人數(shù)多達(dá)數(shù)百人，引發(fā)疫情的“問題蛋”召回?cái)?shù)量達(dá)到5億枚，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，腸炎沙門菌最主要檢測手段仍是生化鑒定配合血清分型，但檢測周期過長，不利于疾控預(yù)防與病情診斷。榮策等［6］建立Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測食品中腸炎沙氏菌的方法。田會(huì)方等［7］采用PCR－焦磷酸測序技術(shù)在沙門菌食物中毒中進(jìn)行了應(yīng)用檢測，但不能鑒定血清型。

焦磷酸測序（pyrosequencing）是一種新的序列分析技術(shù)，其特點(diǎn)是操作簡便、大通量、自動(dòng)化，適合大量樣本的快速檢測，無須進(jìn)行電泳、序列無須熒光標(biāo)記等，是一個(gè)理想的遺傳分析技術(shù)平臺［8－9］。因而廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)［10］、病毒檢測［11］、SNP分析［12］等多個(gè)領(lǐng)域。本研究基于PCR－焦磷酸測序技術(shù)，建立快速檢測腸炎沙門菌的方法加以應(yīng)用。對于方法的特異性、準(zhǔn)確性以及與傳統(tǒng)鑒定相符性進(jìn)行分析，旨在所建立的方法能在食物中毒快速診斷和食品安全領(lǐng)域快速鑒定腸炎沙門菌中得以應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株1 株，臨床分離株13株。陰性對照菌株為鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌等8 株標(biāo)準(zhǔn)菌株，以及22株其他血清型的沙門菌分離株（本實(shí)驗(yàn)室留存），所有菌株信息見表1。所有菌株均經(jīng)過VITEK2、API試劑條和血清學(xué)鑒定。

1.1.2 主要儀器和試劑

PCR 擴(kuò)增儀（PE 9700）；定量遺傳分析系統(tǒng)，Biotage Company；核酸提取儀，Precision System Science（Japan）；PCR 混合緩沖劑、Taq DNA 聚合酶、MgCl2、100bp DNA Marker、瓊脂糖，寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖珠，GE Healthcare（UK）；酶、dNTP、結(jié)合緩沖液、退火緩沖液、變性緩沖液、洗滌緩沖液，QIAGEN（中國）；緩沖蛋白胨水（BPW）、連四硫酸鹽肉湯（TTB），北京陸橋公司。

表1 菌株信息表Tab.1 The list of strains

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù) GenBank 公布的腸炎沙門菌（AF370707.1）序列的保守區(qū)域，采用PyroMark Assay Design 2.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物與測序引物（表2），擴(kuò)增片段大小為176bp。在反向引物5′端標(biāo)記生物素。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表2 腸炎沙門菌PCR 擴(kuò)增引物和測序引物Tab.2 The amplification primers and sequencing primers of Salmonella Enteritidis

1.2.2 模板制備

沙門菌菌株于BPW 37 ℃培養(yǎng)10 h，取10mL接種于TTB增菌液，44.5 ℃培養(yǎng)18h，取1mL菌懸液移入離心管，12 000r／min離 心5min去上清，用1 mL 去離子水漂浮沉淀，12 000r／min離心3min去上清，重復(fù)2次，最后加200μL去離子水，在核酸提取儀上提取DNA，用于PCR 擴(kuò)增。

1.2.3 PCR 擴(kuò) 增

擴(kuò)增體系為50μL，混合緩沖劑25μL，Taq DNA 聚合酶5μL，MgCl21μL，SEF／SER 引物（10μmol／L）各2μL，模板1μL，去離子水14μL。循環(huán)參數(shù)為預(yù)變性95 ℃5min、95 ℃15s、65 ℃30s、72 ℃30s，45個(gè)循環(huán)，72 ℃12min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物一部分進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，另一部分用于焦磷酸測序。

1.2.4 單鏈模板制備及焦磷酸測序

將15μL 的PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至96孔PCR 板中，加入2μL 瓊脂糖珠，20μL 結(jié)合緩沖液和43μL純水，常溫振蕩混合20 min；打開真空泵，利用高純水清洗準(zhǔn)備工具30s并轉(zhuǎn)移至96 孔板，用于抓取瓊脂糖珠；完畢后將攜有瓊脂糖珠的準(zhǔn)備工具放入70%乙醇中5s，再分別在變性緩沖液和洗滌液中各清洗20～30s；準(zhǔn)備工具放在裝有退火預(yù)混液PSQ 96 板上（預(yù)先加入43μL退火緩沖液和2μL測序引物），關(guān)掉真空泵，輕輕搖動(dòng)并釋放磁珠；在80 ℃將PSQ 96 板保溫5min，自然冷卻至室溫后進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)。測序程序采用SQA 模式，按ATCG 的堿基排列順序，依次循環(huán)加入15次，根據(jù)軟件給出的劑量在試劑倉中加入底物混合物、酶混合物和4種脫氧核糖核苷酸，將PSQ 96孔板和試劑倉放入定量遺傳分析系統(tǒng)中進(jìn)行焦磷酸測序。測序峰及相應(yīng)的DNA 堿基序列由儀器SQA 軟件自動(dòng)分析產(chǎn)生。

1.2.5 與傳統(tǒng)生化鑒定方法的比對驗(yàn)證

分別稱取25g豬肉和蝦（無沙門菌污染）為基質(zhì)樣品，每份樣品中加入225 mL 緩沖蛋白胨水，接種腸炎沙門菌 ATCC13076 菌懸液（102cfu／mL），制備2 份模擬樣品。用拍打器拍打20min，37 ℃培養(yǎng)10h。分別取10mL 增菌液移入90 mL TTB 增菌液，44.5 ℃培養(yǎng)18h。然后，取一部分提取DNA 進(jìn)行PCR－焦磷酸測序，另一部分按照GB 4789.4—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門菌檢驗(yàn)》進(jìn)行驗(yàn)證檢驗(yàn)。同時(shí)，對日常進(jìn)出口的食品樣品也采用上述兩種方法檢測腸炎沙門菌，并進(jìn)行比對驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 特異性擴(kuò)增結(jié)果

采用SEF／SER 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和電泳檢測，結(jié)果如圖1 所示。腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC14028及15株分離株（SE1～SE15）均擴(kuò)增出176 bp 的DNA 片段；而鼠傷寒沙門菌ATCC14028、22株其他血清型沙門菌以及大腸埃希氏菌等陰性對照菌株均未見擴(kuò)增條帶。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的腸炎沙門菌PCR 擴(kuò)增引物具有較好的特異性。

圖1 PCR 特異性擴(kuò)增腸炎沙門菌的電泳圖Fig.1 PCR result of Salmonella Enteritidis

2.2 焦磷酸測序結(jié)果

對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序，結(jié)果如表3和圖2 所示。14 株腸炎沙門菌（SE1～SE13、SE ATCC14028）分別測出39～43nt的DNA 序列。將這些序列進(jìn)行BLAST 比對，發(fā)現(xiàn)與Genbank中腸炎沙門菌的核苷酸序列呈100%匹配。其他菌株未出現(xiàn)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶，因而均無測序結(jié)果。結(jié)果表明，焦磷酸測序法可以對腸炎沙門菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

表3 14株腸炎沙門菌的焦磷酸測序結(jié)果Tab.3 Pyrosequencing results of 14 Salmonella Enteritidis strains

圖2 腸炎沙門菌ATCC13076 的焦磷酸測序圖譜Fig.2 Pyrosequencing map of Salmonella Enteritidis ATCC13076

2.3 比對驗(yàn)證結(jié)果

對2份模擬樣品進(jìn)行PCR－焦磷酸測序檢測，均檢測出與預(yù)期相符的腸炎沙門菌的DNA堿基序列，即CCTGTTGTCT GCTCACCATT CGCCAGCCAC。同時(shí)，將模擬樣品按照GB 4789.4—2010進(jìn)行檢測，均分離鑒定出與添加菌株相一致的腸炎沙門菌。

采用本方法共檢測了360份實(shí)際進(jìn)出口食品樣品，在凍雞和雞屁股2份樣品中檢測出腸炎沙門菌陽性。同時(shí)，此樣品也采用經(jīng)典的培養(yǎng)和生化鑒定方法進(jìn)行檢測，結(jié)果符合率為100%。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)建立的焦磷酸測序方法與傳統(tǒng)生化鑒定檢測的結(jié)果相一致，應(yīng)用PCR－焦磷酸測序方法檢測腸炎沙門菌具有較好的應(yīng)用效果。

3 討 論

國內(nèi)外針對食源性致病菌的快速檢測技術(shù)進(jìn)行了廣泛的研究，研究較多的快速檢測技術(shù)是基于實(shí)時(shí)熒光PCR 方法［13－14］，該方法簡便、實(shí)用，但存在著假陽性的可能性。近幾年發(fā)展了更為快速的MALDI－TOF－MS檢測技術(shù)［15］，該方法鑒定準(zhǔn)確，但需要建立在量數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上才能實(shí)現(xiàn)鑒定。也有報(bào)道采用細(xì)菌16SrDNA 基因文庫的構(gòu)建和分析技術(shù)［16］，探討細(xì)菌的多樣性的研究。由此可見，各種檢測技術(shù)都有不同的優(yōu)勢和不足。

焦磷酸測序是一種非常具有潛力的DNA 測序技術(shù)，有著廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域。在短片段測序的應(yīng)用中，可能會(huì)代替Sanger 末端終止法［17］。2005年，Balitzki－Korte等［18］利用焦磷酸測序技術(shù)對人、牛、羊、雞等動(dòng)物的線粒體12SrRNA 基因進(jìn)行了檢測。同年，Allen M 等［19］利用焦磷酸測序技術(shù)對mtDNA 進(jìn)行了檢測，驗(yàn)證了該技術(shù)準(zhǔn)確、靈敏度好。國內(nèi)在此方面也有深入的研究。盧熠川等［20］利用焦磷酸測序方法檢測食品中腸道沙門氏菌，但只是停留在種的水平上。曹冬梅等［21］利用焦磷酸測序技術(shù)檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌，解決了沙門菌種以下水平的血清型的鑒定問題。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)腸炎沙門菌的特異序列，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和測序引物，建立了PCR－焦磷酸測序快速鑒定腸炎沙門菌的方法。通過模擬樣品和實(shí)際樣品的檢測，證明了PCR－焦磷酸測序快速鑒定方法與傳統(tǒng)檢測方法的一致性。與傳統(tǒng)的鑒定方法相比，PCR－焦磷酸測序法縮短了檢測時(shí)間，整個(gè)實(shí)驗(yàn)可以在31h 內(nèi)完成。此外，PCR－焦磷酸測序法可以獲得DNA 堿基序列，準(zhǔn)確性更高，在食品安全快速鑒定、食物中毒快速診斷及醫(yī)學(xué)生物等領(lǐng)域擁有著很好的應(yīng)用前景。

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