郭 馨 澤，劉 彤，黃 忠 剛，葉 淑 紅，肖 珊，王 晗，王 際 輝

（1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.大連市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，遼寧 大連 116023；3.大連博仕奧生物科技有限公司，遼寧 大連 116085）

0 引 言

海洋紅酵母菌體中富含蛋白質(zhì)、糖類、維生素、消化酶及生長因子等多種生理活性物質(zhì)，因此能有效地促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物個(gè)體生長，并能提高水產(chǎn)動(dòng)物的存活率、增強(qiáng)繁殖能力。趙昌會(huì)等［1］的研究結(jié)果表明，海洋紅酵母菌體中含有大量的蛋白質(zhì)和促進(jìn)生長因子，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，通常作為水產(chǎn)動(dòng)物育苗的開口餌料，用于促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長［2－4］。海洋紅酵母菌體中含有的蝦青素在抗氧化、消除自由基方面的功能很強(qiáng)，可以促進(jìn)抗體的產(chǎn)生并增強(qiáng)動(dòng)物的免疫功能［5］。海洋紅酵母可以抑制海洋中的病原微生物［6］，還可以用作水質(zhì)調(diào)節(jié)劑［7－10］。作者對海洋紅酵母搖瓶培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在提高海洋紅酵母的發(fā)酵產(chǎn)量，為大規(guī)模發(fā)酵提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

海洋紅酵母菌株，由大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室從海泥中分離、鑒定并保存，命名為003。

1.1.2 培養(yǎng)基

各種培養(yǎng)基經(jīng)過121 ℃、20 min 高壓滅菌，冷卻至常溫備用。

斜面活化培養(yǎng)基：葡萄糖1.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，氯化鈉1.0%，瓊脂2.0%，蒸餾水100mL，自然pH。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨1.0%，酵母膏0.5%，氯化鈉1.0%，硫酸鎂0.01%，磷酸二氫鉀0.15%，蒸餾水100mL，自然pH。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1.0%，蛋白胨1.0%，酵母膏0.5%，氯化鈉1.0%，硫酸鎂0.01%，磷酸二氫鉀0.15%，蒸餾水100 mL，自然pH。

1.2 方 法

1.2.1 菌株擴(kuò)大培養(yǎng)

斜面活化：將冰箱內(nèi)保存的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上活化，22 ℃恒溫培養(yǎng)24h。

種子培養(yǎng)：斜面培養(yǎng)基22 ℃培養(yǎng)24h后，從斜面接種1環(huán)到裝液量250mL瓶裝50mL的培養(yǎng)基中，于22 ℃、200r／min條件下培養(yǎng)24h。

發(fā)酵培養(yǎng)：以5%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為250mL瓶裝50mL，搖床轉(zhuǎn)速200r／min，于22 ℃培養(yǎng)24h。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

分別比較時(shí)間、溫度、無機(jī)鹽、pH 等不同培養(yǎng)條件下海洋紅酵母菌產(chǎn)量，確定最佳單因素條件。

1.2.3 正交試驗(yàn)

采用四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，共設(shè)9個(gè)處理，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，各因素水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)

在發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行海洋紅酵母菌株5L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)裝料系數(shù)為70%，優(yōu)化培養(yǎng)基滅菌后，以8%的接種量接入海洋紅酵母菌株，培養(yǎng)溫度22 ℃，初始pH 4.8，攪拌速度280～350r／min，通氣量6L／min。每隔3h無菌采樣測定菌量。

1.2.5 酵母細(xì)胞數(shù)測定方法

血球計(jì)數(shù)板法［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 酵母菌的生長曲線

發(fā)酵培養(yǎng)后，從3h開始，每隔3h取樣，進(jìn)行菌量的測定。依據(jù)菌量數(shù)據(jù)繪制該菌株的生長曲線，如圖1所示。

圖1 海洋紅酵母生長曲線Fig.1 Marine red yeast growth curve

發(fā)酵過程菌的生長：在9～24h菌呈對數(shù)生長；24～42h產(chǎn)量基本不變，為生長穩(wěn)定期，產(chǎn)量最高達(dá)9.72×108cfu／mL；42h后進(jìn)入衰亡期，所以在后續(xù)搖瓶試驗(yàn)中，發(fā)酵時(shí)間可采用24h。

2.1.2 碳源對海洋紅酵母菌量的影響

2.1.2.1 碳源種類對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響

選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉來研究不同碳源對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以得出，以葡萄糖作為碳源效果最好，蔗糖次之。葡萄糖來源廣泛，價(jià)格低廉，綜合考慮，選擇葡萄糖作為海洋紅酵母的最佳碳源。

圖2 碳源種類對海洋紅酵母菌量的影響Fig.2 Effect of carbon sources on biomassof marine red yeast

2.1.2.2 碳源濃度對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響

以葡萄糖作為碳源，考察不同濃度對海洋紅酵母發(fā)酵產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖3 所示。在0～1%，隨著葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，菌量增多；在1%～2%菌量較高；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%時(shí)，菌量逐漸下降。通過試驗(yàn)得知，1%時(shí)酵母菌產(chǎn)量相對較高，與2%時(shí)的產(chǎn)量差別不大。綜合考慮，選葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，此時(shí)海洋紅酵母產(chǎn)量為7.92×108cfu／mL。

圖3 葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對海洋紅酵母菌量的影響Fig.3 Effect of glucose concentration on biomass of marine red yeast

2.1.3 氮源對海洋紅酵母酵母產(chǎn)量的影響

選擇蛋白胨、玉米粉、硫酸銨及其組合作為不同的氮源，同時(shí)用酵母膏作為輔助氮源來考察氮源對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖4所示，海洋紅酵母利用不同氮源發(fā)酵的菌體生物量依次為：蛋白胨＋玉米粉＋酵母膏＞蛋白胨＋硫酸銨＋酵母膏＞蛋白胨＋酵母膏＞硫酸銨＋酵母膏＞玉米粉＋硫酸銨＋酵母膏＞玉米粉＋酵母膏。由于蛋白胨＋玉米粉＋酵母膏組合氮源的海洋紅酵母產(chǎn)量最高，而且玉米粉的成本較低，因此選擇玉米粉、蛋白胨和酵母膏作為氮源。

2.1.4 無機(jī)鹽對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響

2.1.4.1 無機(jī)鹽種類對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響

選取0.5%的磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣和氯化鈉這幾種無機(jī)鹽來研究不同無機(jī)鹽對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，相同濃度下以氯化鈉為無機(jī)鹽效果最好，硫酸鎂次之。氯化鈉來源廣泛、價(jià)格低廉，綜合考慮，選擇氯化鈉作為海洋紅酵母的最佳無機(jī)鹽。

圖4 氮源對海洋紅酵母菌量的影響Fig.4 Effect of nitrogen sources on biomass of marine red yeast

圖5 無機(jī)鹽對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of inorganic salts on biomass of marine red yeast

2.1.4.2 無機(jī)鹽濃度對海洋紅酵母菌量的影響

以氯化鈉作無機(jī)鹽，考察不同的無機(jī)鹽濃度對海洋紅酵母發(fā)酵產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖6所示。隨著無機(jī)鹽濃度的增加，酵母菌產(chǎn)量有起伏。當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～1%增加時(shí)，菌量隨之增加，說明在此鹽濃度范圍內(nèi)，鹽濃度增加促進(jìn)了海洋紅酵母的生長速度；當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%～3%時(shí)，隨鹽濃度的增加其生長速度隨之減慢，說明高鹽濃度抑制了細(xì)胞生長。當(dāng)氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)產(chǎn)量最高，產(chǎn)量為8.06×108cfu／mL。

2.1.5 正交試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)確定了培養(yǎng)基的最佳參數(shù)，通過考察葡萄糖、酵母膏、蛋白胨以及玉米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)這4個(gè)因素的相互影響，以海洋紅酵母產(chǎn)量為考察指標(biāo)，得到的正交試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。由表2可知，各種因素對海洋紅酵母影響程度為：葡萄糖＞酵母膏＞蛋白胨＞玉米粉。葡萄糖對菌量的增加作用最顯著，其次是酵母膏，再次是蛋白胨，最后是玉米粉。通過正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到海洋紅酵母最優(yōu)培養(yǎng)基為：葡萄糖1.0%、酵母膏0.5%、蛋白胨0.4%、玉米粉0.1%。

圖6 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of NaCl on biomass of marine red yeast

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab.2 Results of analysis of orthogonal test

2.2 培養(yǎng)條件的影響

2.2.1 pH 對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響

選擇優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基（pH 4.8～6.0），以確定最適的pH，結(jié)果如表3所示。pH 為4.8，即自然值時(shí)酵母菌達(dá)到最大產(chǎn)量。這可能由于低pH 可抑制雜菌，減少污染，所以實(shí)際生產(chǎn)中，要將海洋紅酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH 控制在4.8，這樣既可提高菌量，又在一定程度上控制污染。

2.2.2 溫度對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響

選擇18、22、26、30 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。在18～22℃，隨著溫度的升高，菌量增多；其中，在22和26 ℃時(shí)，菌量較高，且菌數(shù)比較接近，但從節(jié)能角度考慮，選擇22 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。

表3 pH 對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響Tab.3 Effect of pH on biomass of marine red yeast

表4 溫度對海洋紅酵母菌量的影響Tab.4 Effect of temperature on biomass of marine red yeast

2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響

選擇搖床轉(zhuǎn)速為160、180、200、220r／min進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如表5 所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在180～200r／min 隨著搖床轉(zhuǎn)速升高，溶氧量增多，在一定程度上更有利于菌株的生長；但當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到220r／min后，酵母菌產(chǎn)量反而降低。其中，搖床轉(zhuǎn)速200r／min時(shí)的菌數(shù)最高，因此選擇搖床轉(zhuǎn)速200r／min進(jìn)行培養(yǎng)。

表5 搖床轉(zhuǎn)速對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響Tab.5 Effect of shaking speed on biomass of marine red yeast

2.2.4 裝液量對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響

為了考察搖瓶裝液量對菌體產(chǎn)量的影響，選擇250mL 瓶裝10～70mL 的菌液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如表6所示。結(jié)果表明，當(dāng)裝液量為10mL 時(shí)菌數(shù)最高，但不適用于實(shí)際發(fā)酵；當(dāng)裝液量達(dá)到70mL 時(shí)，酵母菌生長受到顯著抑制。綜合考慮選擇相對較優(yōu)的裝液量50mL。

表6 裝液量對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響Tab.6 Effect of volume on biomass of Marine red yeast

2.2.5 接種量對海洋紅酵母產(chǎn)量的影響

考察接種量對于海洋紅酵母產(chǎn)量的影響，結(jié)果如表7所示。當(dāng)接種量為8%時(shí)，海洋紅酵母產(chǎn)量最大。這是由于較小接種量可能使培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)不能被充分利用；而接種量過大可能會(huì)帶入過多的代謝廢物而不利于菌體生長。

表7 接種量對海洋紅酵母菌量的影響Tab.7 Effect of inoculation quantity on biomass of marine red yeast

通過對海洋紅酵母003發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)，得到其最優(yōu)培養(yǎng)條件為接種量8%，初始pH 4.8，搖瓶裝液量50mL／250mL，培養(yǎng)溫度22 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r／min。菌株在此條件下經(jīng)24h的培養(yǎng)，菌數(shù)可達(dá)到1.02×109cfu／mL。

2.3 發(fā)酵罐擴(kuò)大試驗(yàn)

采用優(yōu)化的培養(yǎng)基，以8%的接種量接入5L全自動(dòng)發(fā)酵罐，初始pH 控制在4.8，攪拌速率為280～350r／min，通氣量為6 L／min，溫度為22℃，罐壓為0.05 MPa。每隔3h進(jìn)行采樣，并對菌量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖7所示。

圖7 5L發(fā)酵罐發(fā)酵生長曲線Fig.7 5Lfermentor growth curve

在發(fā)酵過程中，酵母菌在8～18h呈對數(shù)生長；18～28h產(chǎn)量基本不變，為生長穩(wěn)定期，產(chǎn)量最高達(dá)1.05×109個(gè)／mL；28h后進(jìn)入衰退期（圖7）。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，在后續(xù)發(fā)酵罐試驗(yàn)中可選取18h作為發(fā)酵時(shí)間，以節(jié)省生產(chǎn)成本。

3 結(jié) 論

對一株來自海洋泥土中的紅酵母003進(jìn)行了培養(yǎng)條件的優(yōu)化。發(fā)酵培養(yǎng)基的確定：葡萄糖是更適于酵母菌生長的碳源，葡萄糖最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%；以蛋白胨、玉米粉和酵母膏混合氮源對海洋紅酵母的生長最有利；NaCl是海洋紅酵母生長的最佳無機(jī)鹽，當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)海洋紅酵母產(chǎn)量最高。以葡萄糖、蛋白胨、玉米粉、酵母膏為主要因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，最優(yōu)結(jié)果為葡萄糖1.0%，蛋白胨0.4%，玉米粉0.1%，酵母膏0.5%。發(fā)酵條件的優(yōu)化：通過對海洋紅酵母003生長條件的研究，確定了其在pH 為自然值、發(fā)酵溫度22 ℃、接種量8%、裝液量為250 mL 瓶裝50mL發(fā)酵液、轉(zhuǎn)速200r／min時(shí)，酵母產(chǎn)量最高可達(dá)1.02×109cfu／mL，在此條件下海洋紅酵母003生長最好。

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