強(qiáng) 世 龍，張 公 亮，孫 黎 明，侯 紅 漫

（大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）是一種食源性致病菌，主要來源于蝦、魚和貝類等海產(chǎn)品［1］。據(jù)報道，近年來，我國微生物性食物中毒的病原分布發(fā)生了顯著變化，特別是沿海地區(qū)，副溶血性弧菌引起的食物中毒已經(jīng)高居微生物性食物中毒首位［2］。副溶血性弧菌是亞于霍亂弧菌的常見腸道致病菌，在春夏季大連沿海地區(qū)以貝類如紅螺（RapanabezonaLinnaeus）、方形馬珂蛤（Mactraveneriformis）、菲律賓蛤仔（Ruditapesphilippinarum）為主可以生吃的海鮮貝類產(chǎn)品集中上市，而生吃海鮮極易引發(fā)食物中毒，會引起人類腹瀉等腸道疾病及食物中毒，出現(xiàn)腹瀉、腹部痙攣、嘔吐、惡心、和頭痛等癥狀［3－5］。目前對食源性致病菌的檢測仍主要依靠傳統(tǒng)的生化鑒定、細(xì)菌培養(yǎng)、血清學(xué)等方法，檢測周期長（4～7d），操作煩瑣復(fù)雜，已不能適應(yīng)衛(wèi)生應(yīng)急檢測的需要。因此對副溶血性弧菌快速檢測的研究，將有助于預(yù)防這種食源性疾病。

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得PCR 技術(shù)被引入該方面的檢測，如多重PCR 技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)等［6－9］，但以海水貝類為對象檢測副溶血性弧菌的PCR 方法并不多見。本實驗根據(jù)屬特異tl基因［10］和特異性毒力基因tdh［11］作為水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測的靶基因，應(yīng)用雙重PCR 快速檢測海水貝類中副溶血性弧菌。

1 實 驗

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、沙門氏菌（Salmonellasp.）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、大腸桿菌（Escherichia coil）、產(chǎn)氣桿菌（Aerobacteraerogenes），實驗室保存。

1.1.2 試 劑

弧菌顯色培養(yǎng)基、副溶血性弧菌成套生化鑒定管，青島高科園海博生物有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、DNA Marker、溶菌酶、蛋白酶K、RNaseA 以及PCR 相關(guān)試劑，北京天根生化有限公司。

1.1.3 引物序列

以副溶血性弧菌tdh基因和弧菌屬的tl基因作為靶基因分別合成兩對特異性引物（表1），由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.1.4 樣品處理

2013年春夏兩季隨機(jī)挑選大連海鮮集市新鮮紅螺、方形馬珂蛤及菲律賓蛤仔。分為8個批次取樣，紅螺、菲律賓蛤仔、方形馬珂蛤共201份樣品，按采樣時間順序標(biāo)號，每份樣品包裝于無菌塑封袋中，4 ℃冰盒取樣2h內(nèi)送到實驗室檢驗。

在無菌條件下去殼，稱取25g軟組織和體液，置于滅菌研缽中，用滅菌剪刀充分剪碎后研磨。

表1 目的基因及引物序列Tab.1 Target genes and corresponding primer sequences

1.1.5 儀 器

5418R 小型臺式冷凍離心機(jī)，德國艾本德股份公司；JM－250電泳儀，大連捷邁科貿(mào)有限公司；VersaDoc凝膠成像儀，美國伯樂；PCR 擴(kuò)增儀，美國伯樂。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)菌的活化培養(yǎng)

取－80 ℃、25%甘油凍存的菌種，解凍后分別劃線于細(xì)菌培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱24h，連續(xù)活化2次，將單菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，150r／min增菌培養(yǎng)18h。

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA 的制備

取1mL菌液按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行DNA 提取，并溶于30μL雙蒸水中，于－20 ℃下保存。

1.2.3 雙重PCR 的體系建立及優(yōu)化

雙重PCR 擴(kuò)增體系：反應(yīng)總體積為20μL，DNA 模 板1 μL，10×Buffer（Mg2＋）2 μL、2.5mmol／L dNTP（4種脫氧核糖核苷三磷酸的混合物）4μL、兩對2.5mmol／L的上下游引物各0.2μL、Taq酶（2.5U／μL）0.2μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)充至20μL。

PCR 循環(huán)參數(shù)：采用熱啟動，預(yù)變性94 ℃4min，變性94 ℃1min，退火56 ℃1min，延伸72 ℃2min，30個循環(huán)，終延伸72 ℃7min。用含有0.5μg／mL 溴化乙啶（EB）的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照記錄結(jié)果。

以“1.2.2”中提取的副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株菌液DNA 為模板，基于雙重PCR 檢測的初始反應(yīng)體系及條件，分別從引物濃度、模板量、退火溫度等反應(yīng)體系條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 雙重PCR 特異性及靈敏度檢測

特異性檢測：分別提取海水貝類常攜帶的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌及沙門氏菌模板DNA，作為對照菌株，在最佳雙重PCR 體系及條件下擴(kuò)增，驗證本方法用于副溶血性弧菌檢測的特異性。

靈敏度檢測：將過夜培養(yǎng)的副溶血性弧菌菌液用無菌的生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，使目標(biāo)菌濃度由依次為：2.5×107、2.5×106……2.5×102、27、3cfu／mL。分別提取不同濃度菌液的模板DNA，在最佳雙重PCR 體系及條件下擴(kuò)增，確定雙重PCR 的檢測靈敏度。

1.2.5 人工污染紅螺樣品的制備及檢出限檢測

無菌操作取經(jīng)檢測無副溶血性弧菌的紅螺樣品25g，經(jīng)生理鹽水沖洗后，加入營養(yǎng)肉湯中，充分搖勻制成均質(zhì)液，用無菌生理鹽水對初始濃度為2.5×107cfu／mL的副溶血性弧菌菌液作10倍梯度稀釋，取1mL不同稀釋梯度菌懸液人工接種225mL均質(zhì)液中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，150r／min增菌培養(yǎng)8h，提取模板DNA，進(jìn)行雙重PCR 檢測，確定人工污染紅螺樣品的最低檢出限。

1.2.6 海水貝類的實際檢測

以“1.1.4”研磨后樣品分裝500 mL 滅菌三角瓶（已加入225mL營養(yǎng)肉湯），37℃恒溫培養(yǎng)，150r／min增菌培養(yǎng)8h，取增菌液1 mL 提取DNA，進(jìn)行副溶血性弧菌雙重PCR 檢測。

1.2.7 生理生化驗證

根據(jù)GB 4789.7—2013 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗證分析。

1.2.7.1 初步驗證

氧化酶實驗：挑選純培養(yǎng)的單個菌落進(jìn)行氧化酶實驗，副溶血性弧菌為氧化酶陽性。涂片鏡檢：將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。副溶血性弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無芽孢，有鞭毛；挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，轉(zhuǎn)至3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，37 ℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。副溶血性弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，有動力。嗜鹽性實驗：挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，分別接種6%、8%和10%不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化鈉胰胨水（以不加氯化鈉為空白對照），37 ℃培養(yǎng)24h，觀察液體混濁情況。副溶血性弧菌在無氯化鈉和10%氯化鈉的胰胨水中不生長或微弱生長，在含6%和8%氯化鈉的胰胨水中生長旺盛。

1.2.7.2 確定驗證

取純培養(yǎng)物分別接種含3%氯化鈉的甘露醇實驗培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶實驗培養(yǎng)基、MR－VP培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)36h后觀察結(jié)果；利用3%氯化鈉三糖鐵瓊脂隔夜培養(yǎng)物進(jìn)行ONPG 實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 退火溫度優(yōu)化

利用梯度方式對雙重PCR 的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在退火溫度為55、56 ℃時，兩特異條帶同時擴(kuò)增清晰且無引物二聚體，考慮到降低退火溫度可以提高擴(kuò)增效率，最終選取55℃為最佳退火溫度。

2.2 模板量優(yōu)化

雙重PCR 模板量優(yōu)化后表明，只有當(dāng)模板量為1μL時，兩條帶同時擴(kuò)增較為清晰，選擇1μL為雙重PCR 檢測的最佳模板量。

2.3 引物濃度優(yōu)化

雙重PCR 兩對引物體積配比優(yōu)化結(jié)果表明，當(dāng)引物1與引物2的體積比為1∶1時，兩特異條帶亮度一致，擴(kuò)增清晰。

2.4 特異性及靈敏度檢測結(jié)果

如圖1所示，分別以副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及產(chǎn)氣桿菌為模板DNA，按最佳反應(yīng)體系及條件進(jìn)行雙重PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，只有副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株可擴(kuò)增出二條特異條帶，大小為450和269bp，與理論值相符，而其他4株致病菌除引物二聚體外均未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶，說明該雙重PCR 特異性良好。

圖1 雙重PCR 特異性檢測結(jié)果Fig.1 Specificity of the duplex PCR primers

菌懸液濃度梯度稀釋后，經(jīng)菌落平板計數(shù)、對提取不同梯度稀釋模板DNA 進(jìn)行相應(yīng)的雙重PCR。如圖2所示，菌液濃度為2.5×102cfu／mL時，仍可檢出兩條特異條帶，即雙重PCR 檢測純菌液的靈敏度約為2.5×102cfu／mL，該靈敏度可滿足樣品選擇性增菌后的檢測要求。

圖2 雙重PCR 靈敏度檢測結(jié)果Fig.2 Test for the sensitivity of the duplex PCR

2.5 人工污染紅螺樣品的檢出限

檢測結(jié)果如圖3 所示，濃度為2.5×102cfu／mL的菌液污染紅螺樣品仍可檢出，經(jīng)計算，此雙重PCR 檢測模擬污染紅螺樣品檢出限為10cfu／g。

圖3 模擬樣品雙重PCR 檢測結(jié)果Fig.3 The duplex PCR of simulative samples

2.6 雙重PCR快速檢測新鮮海水貝類樣品

以1～77號紅螺樣品、1～63號方形馬珂蛤樣品、1～61號菲律賓蛤仔增菌液的基因組DNA作模板，在雙重PCR 最佳反應(yīng)體系及條件下擴(kuò)增，如圖4 所示。所有PCR 均為陽性樣品。77份新鮮紅螺樣品中共有15份PCR 陽性樣品，63份四角蛤蜊樣品有8份陽性樣品、61份菲律賓蛤仔有5份陽性樣品。

2.7 生理生化實驗驗證結(jié)果

對201份海水貝類樣品（紅螺、方形馬珂蛤及菲律賓蛤仔）中的可疑菌落分別進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢及系列生理生化實驗。圖4結(jié)果與傳統(tǒng)實驗結(jié)果對比可知，28份同時出現(xiàn)兩特異條帶的PCR陽性樣品中均可篩選到鏡檢結(jié)果及生理生化指標(biāo)與副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株相同的陽性菌株，與傳統(tǒng)實驗結(jié)果符合率100%；而沒有條帶出現(xiàn)的樣品中未有副溶血性弧菌菌檢出。

圖4 雙重PCR 檢測新鮮紅螺、方形馬珂蛤、菲律賓蛤仔樣品結(jié)果Fig.4 The duplex PCR result of fresh Rapana bezona Linnaeus，Mactra veneriformis and Ruditapes philippinarum samples

因此，在應(yīng)用雙重PCR 方法檢測海水貝類樣品時，當(dāng)檢測結(jié)果同時出現(xiàn)兩條特異性條帶的樣品，可計為副溶血性弧菌陽性樣品，當(dāng)沒有條帶出現(xiàn)時可計為副溶血性弧菌陰性樣品。表2分別列出春夏兩季鮮活海水貝類樣品中副溶血性弧菌的檢出率。

3 結(jié) 論

本實驗以副溶血性弧菌的特異基因tl與毒力基因tdh為靶基因選擇了兩對引物，檢測海水貝類中副溶血性弧菌的雙重PCR 快速方法。對雙重PCR 的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，使雙重PCR具有良好的特異性以及敏感性，靈敏度可達(dá)到2.5×102cfu／mL。人工污染副溶血性弧菌的海水貝類檢出限為10cfu／g，每批樣品從樣品處理到出結(jié)果只需16h，且便于批量檢測，而傳統(tǒng)培養(yǎng)方法需要4～5d或更長的時間，不宜大批量操作。本實驗所選兩對引物較其他相比敏感性有較大提高，具有廣闊的應(yīng)用前景和較強(qiáng)的實際應(yīng)用價值，為大連周邊海鮮集市海水貝類的副溶血性弧菌檢測提供一種有效的檢測方法。

對海鮮市場隨機(jī)抽取的77份新鮮紅螺樣品、63份方形馬珂蛤樣品、61份菲律賓蛤仔進(jìn)行雙重PCR 的實際檢測，經(jīng)驗證，最終共檢出陽性樣品28份，春夏兩季紅螺樣品中副溶血性弧菌的檢出率分別為13.3%、25%，方形馬珂蛤為6.7%、21.2%，菲律賓蛤仔為0、16.1%。由三類樣品兩季檢出率對比可知，春季檢出率均較低、夏季檢出率均較高。隨著天氣逐漸轉(zhuǎn)暖，致使一些食源性副溶血菌不容易滅活，所以生吃海鮮尤其在夏季可能會引起食物中毒，或者感染性的腸道腹瀉，副溶血性弧菌在海水貝類中的危險性不容忽視。

表2 春夏兩季鮮活海水貝類樣品中副溶血性弧菌檢出率Tab.2 Vibrio parahaemolyticus detection rate of fresh shellfish samples in spring and summer

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