茍 陽，楊武晨，楊 程 綜述，彭賢貴 審校

（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院血液科，重慶400037）

血液系統(tǒng)腫瘤包括髓系和淋系兩大類，最常見的髓系腫瘤有骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN），骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）和急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）等。環(huán)境、年齡、機體本身等因素作用使得細(xì)胞的分化阻滯、異常增殖發(fā)生在機體造血的不同階段，引起不同血液系統(tǒng)腫瘤亞型的產(chǎn)生。近年來，隨著二代測序［1］，單細(xì)胞分析技術(shù)［2］，基因芯片，基因表達(dá)譜分析等基因分析技術(shù)及異種移植技術(shù)等動物實驗技術(shù)［3］的成熟應(yīng)用，腫瘤細(xì)胞的基因特征、基因表達(dá)變化過程和致病特征已經(jīng)越來越清晰。關(guān)于腫瘤基因相關(guān)致病機制的研究主要有腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）［4］和克隆演變理論［5］，本文將重點闡述克隆演變理論在髓系腫瘤發(fā)病機制中的應(yīng)用。

1 克隆演變理論基礎(chǔ)

Nowell［6］在1976年首先提出腫瘤是由多步驟的體細(xì)胞突變形成，經(jīng)過不斷克隆選擇的一個進(jìn)化的過程，以后的眾多研究也證實了這一點［7-8］。細(xì)胞在不斷的分裂過程中，都有可能發(fā)生基因突變，發(fā)生突變的細(xì)胞與未發(fā)生突變的細(xì)胞對環(huán)境的適應(yīng)能力不一樣，適應(yīng)力強的細(xì)胞優(yōu)勢生長，某種基因突變賦予細(xì)胞的生存優(yōu)勢可用適應(yīng)度值定量，適應(yīng)度值越大，越利于細(xì)胞生長。Bozic等［9］用公式估計當(dāng)腫瘤中某種突變的適應(yīng)度大于0.4%時，這個突變即為主導(dǎo)突變，其余的為過客突變。同一個細(xì)胞克隆具有相同的生長能力，細(xì)胞生長過程中多個主導(dǎo)突變的系列出現(xiàn)則可能產(chǎn)生多個細(xì)胞克隆群體。若最終的細(xì)胞克隆依次來源于相同的母細(xì)胞，則為線性克隆演變模式；若來源于不同的母細(xì)胞，則為分支模式。

移植的成功首先證實了造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）的存在，造血也自此被描述為是由HSC 不斷分化、發(fā)育、成熟為各系的造血前體細(xì)胞及各階段的成熟細(xì)胞的過程。在造血過程中，若隨機發(fā)生的某種突變在某種環(huán)境中的適應(yīng)度值大，則可能導(dǎo)致某個克隆群體的過度生長。當(dāng)這種基因突變發(fā)生在僅有增殖能力（如成熟細(xì)胞）的細(xì)胞上時，這些突變將隨著細(xì)胞死亡而丟失；但如果該種基因突變能使細(xì)胞的自我更新能力增加或發(fā)生在有自我更新能力的細(xì)胞上（如HSC 和造血前體細(xì)胞），則具有突變的細(xì)胞群體會不斷壯大，正常細(xì)胞群體不斷縮小，最終導(dǎo)致腫瘤形成。

2 髓系腫瘤的克隆演變

二代測序可通過VAF值［10］及Miller等［11］分析方法直接判斷樣本中的細(xì)胞克隆數(shù)，通過細(xì)胞表面標(biāo)志分離特定的細(xì)胞類型結(jié)合體外培養(yǎng)單克隆技術(shù)，單細(xì)胞技術(shù)等對初診與復(fù)發(fā)的、慢性與急性的髓系腫瘤，以及MDS與AML 前后的樣本基因組進(jìn)行比較分析等，都可得到腫瘤的克隆演變情況，更多的遺傳學(xué)上的克隆分析方法也在越來越多地應(yīng)用到腫瘤的研究中［5］。

2.1 髓系腫瘤的克隆結(jié)構(gòu) 在各種髓系腫瘤中，AML平均基因突變數(shù)最多，MDS次之，MPN 最少，分別約為13.0、1.8、0.6個突變／樣本［12-14］?；蛲蛔冸S著細(xì)胞分裂而發(fā)生，眾多的基因突變類型決定了最終腫瘤多克隆的存在（不同的細(xì)胞克隆基因突變類型不一樣）。克隆結(jié)構(gòu)最復(fù)雜為AML，MDS 次之，MPN 最簡單。200個AML患者中超過50%有1個主克隆和1～3個亞克?。?2］；在313個具有2個以上突變的MDS患者中，62%的患者為單克隆，34%有亞克隆存在［15］；大部分MPN患者只有1個基因突變，為單克隆的存在［14］。

2.2 髓系腫瘤的克隆演變模式 在多克隆存在的情況下，AML、MDS和MPN 均有線性克隆演變模式和分支模式。有研究證明1個MDS患者中僅存在線性模式［16］。在6個雙克隆MDS中，3個樣本中CD34-細(xì)胞的基因突變與CD34＋細(xì)胞的突變相同，說明這些CD34-細(xì)胞由突變的CD34＋細(xì)胞來源，而另外有3 個則不是，證明線性模式與分支模式均存在［17］。在8個具有多基因突變的MPN 中，4個為線性模式，4個為分支模式，且其基因突變克隆演變圖可以被完整描繪出［14］。AML的轉(zhuǎn)化與復(fù)發(fā)也與克隆狀態(tài)有關(guān)。對7個MDS和轉(zhuǎn)化的AML 比較說明AML 的轉(zhuǎn)化與1個亞克隆的過度生長有關(guān)［18］。AML復(fù)發(fā)后與復(fù)發(fā)前對比分析說明AML 的復(fù)發(fā)可能為主要克隆增加額外突變，或亞克隆增加突變進(jìn)展導(dǎo)致［19-21］。

2.3 髓系腫瘤的克隆演變原因及發(fā)病機制 不同的突變基因在不同環(huán)境下的不同增殖優(yōu)勢導(dǎo)致不同的腫瘤克隆形成。多克隆結(jié)構(gòu)的存在取決于多種優(yōu)勢基因突變類型的先后出現(xiàn)，若突變賦予的細(xì)胞的生長優(yōu)勢強，則細(xì)胞傾向于線性增長模式，若2個基因突變賦予細(xì)胞的生長優(yōu)勢都不是很強，則可能導(dǎo)致分支結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生［5］。通常不能事先知道某種基因突變在某種環(huán)境中賦予的細(xì)胞的增殖優(yōu)勢有多大，但可以通過腫瘤的克隆結(jié)構(gòu)與相應(yīng)突變基因的功能推測這些基因突變的作用大小。

2.3.1 具有決定性意義的基因突變 極小部分髓系腫瘤有特異的基因突變，如BCR-ABL、AML1-ETO、MLL-AF9、NUPHOXA9、PML-RARα，對于這些腫瘤和基因研究最為清楚。將含有這些特定基因突變的細(xì)胞植入免疫抑制的小鼠體內(nèi)能直接誘導(dǎo)小鼠類似人類相應(yīng)白血病的產(chǎn)生［22-24］，這些特定的基因突變往往決定著細(xì)胞重要的生化反應(yīng)過程。而直接誘導(dǎo)小鼠白血病產(chǎn)生的具有特定基因突變的細(xì)胞類型可以是CD34＋CD38-的細(xì)胞［25］，也可能是CD34＋CD38＋和CD34-細(xì)胞，或者它們的混合物［26］，說明即使是一些很關(guān)鍵的基因突變也不是單獨存在于HSC 上就能引起白血病，還需要后期突變和后期細(xì)胞的參與。小鼠模型中2個基因突變比單個突變能更快更高地植入引起AML 的產(chǎn)生［27-29］，持續(xù)緩解患者體內(nèi)AML1-ETO 持續(xù)存在，但需要其他基因的參與才能引起發(fā)?。?0］，這些事實也說明了上述觀點。但是這些腫瘤的克隆結(jié)構(gòu)一般都比較簡單。

在慢性髓系白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）和AML-M3中，BCR-ABL 和PML-RARα的突變均發(fā)生在HSC上［29］?？梢酝茰y，由于PML-RARα基因的表達(dá)對早幼粒細(xì)胞的分化阻滯影響較大，故最終腫瘤中有大量早幼粒細(xì)胞異常的克隆群體；而BCR-ABL基因的表達(dá)對細(xì)胞的分化阻滯影響不大，而可以促進(jìn)各階段粒細(xì)胞的過度增殖，故最終腫瘤中各階段粒細(xì)胞數(shù)都特別多。

2.3.2 克隆演變基因改變的出現(xiàn)順序 大部分的白血病無法由基因突變的細(xì)胞直接誘導(dǎo)產(chǎn)生，一個患者常具有多種不太特異的基因突變類型，髓系腫瘤基因突變類型根據(jù)功能大概分為幾大 類［12］，信 號 途 徑 成 分：如ABL、CBL、FGFR1、FLT3、JAK2、KIT、LNK、MPL、PDGFR、PTPN11、RAS；轉(zhuǎn)錄因子：如CEBPA、GATA2、RARA、IKZF1、RUNX1、ETV6、NPM1；表觀遺傳學(xué)調(diào)控基因：如ASXL1、MLL、DNMT3A、EZH2、TET2、SUZ12、MYST3、UTX；抑癌基因：如TP53、WT1、CDKN2A；剪接體成分：如SF3B1、SRSF2、U2AF1、ZRSR2；其余少量分類不是很明確。

同一功能類基因突變一般不同時出現(xiàn)，如信號途徑突變的基因常不同時出現(xiàn)，但表觀遺傳學(xué)中ASXL1和EZH2，TET2等突變可同時出現(xiàn)；不同類基因突變常同時出現(xiàn)，信號途徑基因突變和表觀遺傳學(xué)基因突變、表觀遺傳學(xué)基因突變和剪接體成分相關(guān)基因突變常同時出現(xiàn)，如CBL／KIT 常出現(xiàn)在CBF AML 中，DNMT3A 和FLT3、NPM1同時出現(xiàn)，U2AF1 和ASXL1同時出現(xiàn)［31］。

在眾多的基因突變類型和突變細(xì)胞中，很重要的一點就是尋找起始突變或早期突變。起始突變與白血病細(xì)胞克隆的演變及后期突變的獲得密切有關(guān)。具有一些重要的早期突變的HSC或前體造血細(xì)胞也被稱為白血病前干細(xì)胞［32-33］。表觀遺傳學(xué)相關(guān)突變是早期突變中比較重要的一種。（1）調(diào)節(jié)甲基化狀態(tài)的甲基化相關(guān)基因，如IDH1／2，DNMT3A，EZH2，ASXL-1作為早期突變出現(xiàn)的頻率比較大［34］；（2）在HSC的基因突變類型中，表觀遺傳學(xué)的改變速度比基因改變的速度要高幾個數(shù)量級［31］；（3）CPG 的甲基化與去甲基化狀態(tài)、組蛋白甲基化、染色體構(gòu)象改變等可直接廣泛影響多種基因的表達(dá)；（4）甲基化相關(guān)基因缺失的小鼠模型都表現(xiàn)出了細(xì)胞增殖能力增強［35-38］，這可以賦予突變細(xì)胞一個生存優(yōu)勢。

表觀遺傳學(xué)相關(guān)基因改變常為早期突變，但也可為晚期突變，其余各類基因突變的出現(xiàn)順序不十分明確。AML患者中，F(xiàn)LT3-ITD常為晚期出現(xiàn)的突變，而NPM1、TET2、SKP2、SMC1A 等可能為早期突變［33］；MPN 中，TET2、DNMT3A 先于JAK2V617F突變出現(xiàn)，IDH1后出現(xiàn)，CALR為早期突變［39］；MDS患者中，SF3B1和GATA2基因突變先于TET2和EZH2突變的出現(xiàn)［40］。

基因突變的出現(xiàn)是隨機的，環(huán)境因素決定哪些基因突變可以被選擇保留，后出現(xiàn)的突變可被先出現(xiàn)的突變驅(qū)使產(chǎn)生，起始突變尤為重要，而多克隆的出現(xiàn)源于每一步出現(xiàn)的突變的幾種可能性，決定總共需要幾個這樣的突變和可能的組合很重要［31］。

3 總 結(jié)

眾多的腫瘤學(xué)研究證實腫瘤是一個符合達(dá)爾文自然選擇理論的一個多步驟進(jìn)化演變過程［5-8］。在多種腫瘤中，髓系腫瘤的基因突變數(shù)最少［41］，克隆演變過程也最簡單。不同的突變基因在不同環(huán)境下的不同增殖優(yōu)勢致使不同的腫瘤克隆形成。突變基因?qū)?xì)胞生理生化特性影響大，相應(yīng)腫瘤的產(chǎn)生將有一個快速和簡單的克隆演變過程，反之較復(fù)雜［42］。起始于HSC上的某些個特異的基因突變?nèi)鏐CR-ABL、PML-RARA、AML1-ETO、MLL重排等對細(xì)胞增殖分化影響比較大，與特定的已知的髓系腫瘤亞型直接相關(guān)，且多為單克隆結(jié)構(gòu)。JAK2突變、CALR 突變和MPL突變可通過影響共同的JAKSTAT 信號途徑來導(dǎo)致MPN 的形成［43］，也多為單克隆結(jié)構(gòu)。大部分的AML及MDS沒有特異的基因突變，但多有前述五大類基因突變中的一類或幾類。各類基因突變對細(xì)胞的生理生化功能的影響強弱不一樣，在不同個體中出現(xiàn)的先后順序不一樣，在同一腫瘤中出現(xiàn)的克隆群體也可能不一樣，相對而言，表觀遺傳學(xué)改變相關(guān)基因多可出現(xiàn)在克隆演變早期［33-34］。信號途徑改變（JAK2-STAT 以外的）、轉(zhuǎn)錄因子及表觀遺傳學(xué)改變常伴隨且高頻出現(xiàn)在AML 中，常為多克隆結(jié)構(gòu)；剪接體相關(guān)突變及甲基化相關(guān)基因突變在MDS和慢性粒單核細(xì)胞白血?。╟hronic myelomonocytic leukemia，CMML）中出現(xiàn)頻率很高，與其病態(tài)造血及增殖優(yōu)勢密切相關(guān)［44］，可為多克隆結(jié)構(gòu)。

CML、AML-M3等基因突變和克隆結(jié)構(gòu)簡單的腫瘤通過突變基因藥物靶向治療，可以取得很好的療效；而對于多克隆多基因突變的腫瘤細(xì)胞群體來說，針對于含有某種基因突變的某個細(xì)胞克隆群體的靶向治療將不能達(dá)到良好療效。相反，一個克隆群體的殺滅將利于另一個克隆群體的增長，導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生。因而，刻畫出每個患者的基因突變的腫瘤細(xì)胞的克隆進(jìn)化圖，將利于最終真正有針對性地進(jìn)行每個患者的靶向治療。

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