王 娜，武坤毅，崔浪軍，章華偉

(1 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，藥用植物資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室，陜西 西安 710062；2 浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

溶桿菌屬細菌鑒定及生防機制概況

王 娜1，武坤毅1，崔浪軍1，章華偉2

(1 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，藥用植物資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室，陜西 西安 710062；2 浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

溶桿菌屬的大部分細菌具有重要的生防前景，因而受到了高度關(guān)注。為了明確目前溶桿菌屬細菌的研究現(xiàn)狀，分析了已報道的26種溶桿菌屬細菌的分布環(huán)境及典型的生化特征，基于16S rDNA序列相似性和脂肪酸組成構(gòu)建了26種溶桿菌屬細菌的系統(tǒng)進化樹，并輔以DNA-DNA雜交結(jié)果進行佐證，闡述了溶桿菌屬細菌對病原菌、線蟲病害的生物防治物質(zhì)及其作用機理，并對其生物安全和應(yīng)用前景進行了展望。

溶桿菌屬；細菌鑒定；DNA-DNA同源雜交；生物防治

溶桿菌屬(Lysobacterspp.)屬于變形桿菌門(Proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gmmaproteobaeteria)、黃單胞菌目(Xanthomonadaceae)、黃單胞科(Xanthomonadaeeae)。早在1966年，有研究者發(fā)現(xiàn)，有1株細菌能產(chǎn)生堆囊黏菌素，這種堆囊黏菌素是一種吩嗪類抗生素，對大多數(shù)細菌和真菌具有廣譜的抑制作用[1]。在此基礎(chǔ)上，1978年，Christensen等[1]在加拿大舉行的細菌分類學(xué)大會上首次提出溶桿菌屬，該屬與假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、 寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、熱單胞菌屬(Thermomonas)和木桿菌屬(Xylella)等的親緣性較近[2]。目前已報道的溶桿菌屬的大多數(shù)細菌對病原真菌、G+細菌、線蟲和綠藻均有突出的拮抗作用[3]。隨著近年來溶桿菌屬新種的不斷發(fā)現(xiàn)，該屬細菌在生物防治領(lǐng)域巨大的應(yīng)用前景受到高度關(guān)注。本研究就溶桿菌屬細菌的主要鑒定特征和生物防治病蟲害機制的最新研究進展進行綜述，以期為該屬細菌的開發(fā)利用提供參考。

1 溶桿菌屬細菌種類

在溶桿菌屬提出之前，大部分細菌新種的分類和鑒定是根據(jù)滑動性和溶菌活性將具有相似表型的細菌分開。1978年，Christensen等[1]發(fā)現(xiàn)了溶桿菌屬細菌，雖然其與黏細菌表型相似，但不具有黏細菌產(chǎn)生子實體的特征，且溶桿菌屬細菌DNA的G+C含量大于60%，而黏細菌DNA的G+C含量相對較低[3]。因此，溶桿菌屬作為一個新屬被提出。

溶桿菌屬自1978年命名以來，截至2012年底，在國際菌種鑒定權(quán)威雜志《國際微生物體系分類學(xué)》(IJSEM)期刊上命名的溶桿菌屬細菌有26種[1,2,4-22]。如表1所示，在這26種溶桿菌屬細菌中，在韓國發(fā)現(xiàn)的有12種，在中國發(fā)現(xiàn)的有7種，其余7種分別在加拿大、印度和菲律賓被發(fā)現(xiàn)；這些細菌中除5株是在淡水、胡椒根系、水系沉積物、深海海綿和水稻根系中發(fā)現(xiàn)的外，其余21株均在不同類型的土壤中被發(fā)現(xiàn)。這些土壤類型包括濕度相對較大的溫室土壤和人參根際土壤、受強紫外線或地?zé)彷椛涞母稍锿寥?、金屬礦集區(qū)土壤、被厭氧細菌或百菌清嚴重污染的土壤，其中在濕度相對較大土壤中發(fā)現(xiàn)的種類較多，說明溶桿菌屬細菌在土壤中有廣泛的適應(yīng)性。

2 溶桿菌屬細菌的生化特征

溶桿菌屬菌株菌體呈桿狀，兩端鈍圓，單生，大小一般為(0. 2～0. 5) μm×(2～70) μm[23]，無鞭毛，但具有滑行能力，表面光滑有規(guī)則，好氧性強，革蘭氏染色陰性，無芽孢，能夠生長的溫度為15～42 ℃，最適生長溫度為25～40 ℃，大部分可以在TSA、NA和LB培養(yǎng)基上生長，菌落顏色有奶油色、淡黃、黃色幾種[1,2,4-22]。細菌不同種之間的表型差異很小，僅憑形態(tài)學(xué)特征難以區(qū)分和鑒別，需要根據(jù)其生理生化指標(biāo)的差異進行分析與鑒定。

綜合前人的研究成果[1,2,4-22]可知，G+C含量高(61.7%～70.7%)且含有輔酶Q-8是溶桿菌屬細菌的2個標(biāo)志性特征。其他特征還有：氧化酶(L.koreensis、L.ximonensis除外)、過氧化氫酶(L.daejeonensis、L.yangpyeongensis和L.panaciterrae除外)檢測結(jié)果為陽性；硝酸鹽還原性(L.daejeonensis、L.brunescens和L.defluvii除外)檢測結(jié)果為陰性；大部分能水解利用七葉樹素(L.daejeonensis、L.antibioticus、L.concretionis、L.niaboensis、L.niastensis和L.spongiicola除外)和明膠(L.korlensis除外)；α-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶等細菌代謝關(guān)鍵酶活力大部分檢測顯示陰性。溶桿菌屬細菌對營養(yǎng)要求相對較低，碳源的利用范圍廣泛，能利用D-葡萄糖、D-樹膠醛醣、D-甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖等單糖，還可以利用麥芽糖等二糖以及糖原等多糖，也能利用其他碳源，如蘋果酸、檸檬酸鈉；但其中一部分細菌如L.dokdonensis、L.ruishenii和L.daecheongensis對碳源的利用情況尚不清楚，還有待進一步研究。這些結(jié)果表明，用傳統(tǒng)的經(jīng)典分類方法，僅僅依據(jù)形態(tài)特征和生理生化特性進行溶桿菌屬種的確定是不夠的，因此還需要采用其他有效的分析手段對其進行分類研究。

3 基于16S rDNA序列的溶桿菌屬細菌的進化分析

由于細菌的全基因組數(shù)量迅速增加，利用比較基因組學(xué)能更清晰地分析基因組進化。通過基因組分析可以識別噬菌體或其他具有DNA的區(qū)域，從而預(yù)測是否發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移，分析相關(guān)基因組之間的演變，也可說明距離較遠的發(fā)育相關(guān)細菌之間的關(guān)系[2]。16S rDNA基因大小1.5 kb 左右,含有高度保守的基因片段，同時在不同的菌株間也含有變異的核酸片段。通過對其序列的分析，結(jié)合完善的數(shù)據(jù)庫，可以簡單、快速地對細菌進行分類鑒定，確定細菌在進化中的位置，是細菌分類學(xué)中非常重要的方法[24]。當(dāng)鑒定同源性較高的細菌時，可用其他方法作為補充。

對表1中26種溶桿菌屬細菌的16S rDNA基因序列進行同源比對，并用MEGA 4.0軟件包中的Kimura-2-parameter法計算遺傳距離，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖1。由圖1可知，L.thermophilus和L.xinjiangensis分成2個單獨的分支，其他24株細菌分成了4個單獨但相關(guān)的集群。

由圖1可知，L.gummosus，L.antibioticus，L.capsici，L.niastensis，L.soli，L.enzymogenes，L.xinmonensis，L.dokdonensis，L.ginsengisoli，L.panaciterrae，L.brunescens和L.daecheongensis組成1個集群；L.daejeonensis，L.ruishenii，L.defluvii，L.spongiicola，L.concretionis和L.arseniciresistens組成1個集群；L.koreensis，L.niabensis，L.yangpyeongensis和L.oryzae組成1個集群；L.bugurensis和L.korlensis組成1個集群。26種溶桿菌屬細菌中，L.capsici與L.gummosus和L.antibioticus16S rDNA序列的相似百分率為100%，三者相似性最高；其次是L.daejeonensis與L.ruishenii，其16S rDNA序列相似百分率為98%，二者相似性較高。該系統(tǒng)發(fā)育進化樹清楚地說明了這26個溶桿菌屬細菌之間的親緣性關(guān)系。

目前，采用16S rDNA測序方法鑒定細菌親緣關(guān)系時主要依靠序列間的相似百分率。Bosshard等[25]將16S rDNA序列相似百分率大于99%的細菌定義為同種內(nèi)的不同亞種，相似性在95%～99%的則定義為屬內(nèi)相關(guān)的種。但隨著細菌基因組測序的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)16S rDNA序列相似百分率即使達到99%以上，在分類學(xué)上也可能屬于不同的種[26]，說明對細菌進行系統(tǒng)分類鑒定不能采取單一的標(biāo)準(zhǔn)。如L.capsici與L.gummosus和L.antibioticus的 16S rDNA序列相似百分率為100%，三者之間同源性很高，但為不同的種。因此，必須同時結(jié)合DNA同源雜交、形態(tài)特征、生理生化特征、脂肪酸含量測定等多項指標(biāo)進行綜合分析，才能給予溶桿菌屬新種準(zhǔn)確的鑒定結(jié)論[27]。

4 基于脂肪酸組成的溶桿菌屬細菌的聚類分析

脂肪酸具有結(jié)構(gòu)多樣性和較高的生物學(xué)特異性，是特別有效的生物標(biāo)記物[28]。通過微生物脂肪酸的組分來鑒定微生物的種屬，分析微生物的多樣性，是一種簡便、可靠的分析方法。根據(jù)26種溶桿菌屬細菌脂肪酸含量的百分比可知，溶桿菌屬細菌標(biāo)志性的脂肪酸主要是iso-C15:0、iso-C16:0和iso-C17:1ω9c，其中iso-C15:0的含量相對最高。根據(jù)26種細菌的脂肪酸含量，用SPSS 18.0中的聚類分析(Hierarchicalcluster)以類間平均連鎖法(Between-groups linkage)進行聚類，通過平均距離法制圖，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可見，全部26種細菌聚為一類時，類合并距離尺度為25；在距離尺度僅約為10時可分為4類，其結(jié)果與基于16S rDNA序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹分類結(jié)果保持相對較高的一致性，這與前人在其他革蘭氏陰性菌中的研究結(jié)果[28]一致。在這26種細菌中，L.ruishenii與L.ginsengisoli為2個單獨的分支，L.gummosus、L.panaciterrae、L.soli、L.niastensis、L.daecheongensis、L.enzymogeneL.capsici和L.antibioticus組成1個集群，L.bugurensis和L.korlensis組成1個集群，其余的組成1個集群。

由圖2還可知，具有相似脂肪酸組成的細菌聚合為單一集群，這些細菌來自相近的環(huán)境，其16S rDNA序列具有較近的“親緣關(guān)系”(圖1)。如L.daejeonensis、L.yangpyeongensis、L.dokdonensis等均分離自相對潮濕的土壤，這些細菌在16S rDNA序列相似性和脂肪酸組成上保持高度一致。此外，均分離自中國干旱地?zé)嵬寥乐械腖.xinjiangensis和L.thermophilus等細菌之間，也存在16S rDNA序列相似性和脂肪酸組成保持高度一致的現(xiàn)象。以上結(jié)果有力地說明，環(huán)境因素極可能對脂肪酸組成造成影響，相似環(huán)境下的細菌具有更為相似的脂肪酸組成。

5 溶桿菌屬細菌的DNA-DNA同源性雜交鑒定

細菌分類學(xué)上不同物種之間能進行DNA同源雜交，其基本原理是用DNA解鏈的可逆性和堿基配對的專一性，將不同來源的DNA在體外加熱解鏈，并在合適條件下使互補的堿基重新配對，測算雜交百分數(shù)。百分數(shù)越高，雜交的2個DNA堿基線性序列的同源性就越高，說明其親緣關(guān)系就越近[29]。因此通過DNA同源雜交鑒定物種之間的親緣關(guān)系，是細菌鑒定中最為重要的證據(jù)。按照國際分類委員會的建議，將DNA同源性70%作為定種的界限，即同源性≥70%為同一個種群，同源性<70%為不同種群[28]。例如通過DNA同源雜交鑒定溶桿菌屬新菌株L.ginsengisoliGsoil357T、L.daecheongensisDae08T和L.spongiicolaKMM329T，結(jié)果表明L.ginsengisoliGsoil357T與L.gummosusDSM6980T、L.antibioticusDSM2044T之間的DNA同源性分別為16.3%和16.2%[19]，L.daecheongensisDae08T與L.brunescensDSM6979T之間的DNA同源性為28%[15]，L.spongiicolaKMM329T與L.concretionisKCTC12205T之間的DNA同源性為48%[9]，因此鑒定L.ginsengisoliGsoil357T、L.daecheongensisDae08T和L.spongiicolaKMM329T為溶桿菌屬中獨立的種。但最新的研究表明，即使溶桿菌屬2種細菌的16S rDNA序列相似率達到99%以上，二者基因組DNA雜交同源性百分數(shù)也可能遠在70%以下[30-31]，而且其生理生化指標(biāo)、細胞化學(xué)組分等方面的特征也有明顯的差異，在分類鑒定中可命名為不同的種，這對于新種的確定和細菌不同種的鑒定提供了準(zhǔn)確、快速、有效的證據(jù)[27]。如1978年，Christensen 和Cook 提出了L.enzymogenes細菌的亞種，命名為L.enzymogenes，但此亞種的名稱在細菌命名中一直未得到批準(zhǔn)，該名稱的術(shù)語也未被驗證[5]。最新研究報道表明[26]，此亞種細菌L.enzymogenesPAGU1119T與L.enzymogenesDSM2043T、L.capsiciYC5194T之間16S rDNA序列的相似率分別為97.2%和99.4%，全基因組DNA同源雜交百分數(shù)分別為20.7%～26.1%和60.9%～62.0%，這說明與L.enzymogenesDSM2043T細菌相比，L.enzymogenesPAGU1119T與L.capsiciYC5194T的親緣關(guān)系更近。但進一步的試驗分析表明，L.enzymogenesPAGU1119T與L.capsiciYC5194T的生化特征、脂肪酸含量等特征差異性較大[26]，因此Kawamura等[26]提出，將L.enzymogenesPAGU1119T視為溶桿菌屬1個獨立的新種，并重新命名為L.cookiisp.。

6 溶桿菌屬細菌的生防物質(zhì)及作用機理

已報道的溶桿菌屬的大多數(shù)細菌對許多病原菌有顯著的拮抗作用[3]。截至2012年底，溶桿菌屬26種細菌中，只有L.enzymogenesC3等少數(shù)幾種細菌的胞外主要抑菌物質(zhì)被分離得到，這些物質(zhì)主要有胞外酶、小分子化合物及生物表面活性劑和抗生素3大類(表2)。

6.1 胞外酶

與其他生防菌相比，溶桿菌屬細菌能夠分泌幾丁質(zhì)酶、β-1, 3-葡聚糖酶等多種胞外酶。如L．enzymogenesC3、L.enzymogenesOH11能大量分泌幾丁質(zhì)酶，該酶通過水解病原真菌細胞壁抑制其增殖，從而提高植物的抗真菌能力[34]。L．a(chǎn)ntibioticusHS124、L.enzymogenesOH11分泌的β-1,3-葡聚糖酶通過催化細胞壁中的β-1, 3-葡聚糖多聚體水解,將其降解為葡萄糖，從而抑制真菌的生長及增殖[47]。L.enzymogenes3.1T8分泌的α-水解蛋白酶能降解線蟲體壁的蛋白質(zhì)，該蛋白酶由前肽區(qū)(Pro)和蛋白酶區(qū)(Alp)組成，其中前肽區(qū)參與該酶的正常折疊，影響其水解活性[36]。

6.2 小分子化合物

溶桿菌屬細菌分泌于胞外的活性小分子物質(zhì)主要包括HSAF、WAP-8294A2、Lysobactin、Cephabacins和Tripropeptins等，其中L.enzymogenesC3、L.enzymogenesOH11分泌的熱穩(wěn)定抗真菌因子(HSAF)對絲狀真菌和卵菌有顯著的抑制作用。HSAF對絲狀真菌的作用機制，主要是通過抑制真菌神經(jīng)酞胺合成酶活性，改變細胞膜中的鞘脂類化合物的組成，最終導(dǎo)致靶標(biāo)真菌菌絲的去極化[48]。目前，這些活性小分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)基本都已被闡明。

此外，關(guān)于HSAF與WAP-8294A2生物合成關(guān)鍵調(diào)控基因的研究報道較多。其中留醇脫氫酶基因(Sterol desaturase，SD)是HSAF生物合成中的關(guān)鍵基因，SD基因催化3-deOH HSAF(3-dehydroxy HSAF)轉(zhuǎn)化為HSAF,且鐵氧化還原酶基因(Ferredoxin reductase，F(xiàn)NR)的參與能夠明顯增強SD基因的催化活性[49]。WAP-8294A2生物合成過程中需要酞基轉(zhuǎn)移酶(Acyl-CoA ligase,ACL)激活3-OH脂肪酸鏈和酞基轉(zhuǎn)移蛋白，且WAP-8294A2已進入臨床Ⅰ期試驗階段[50]。

6.3 生物表面活性劑、抗生素

L.enzymogenes3.1T8、L.enzymogenC3分泌的生物表面活性劑，對由立枯絲核菌引起的肯塔基藍草病害(PoapratensisL.)等具有顯著的抑制效果，其作用機制是該活性劑能阻止真菌孢子游動及萌發(fā)，建立與細菌細胞之間的聯(lián)系，克服細胞之間的疏水阻力，降低病原菌游動孢子的表面張力，在細胞膜內(nèi)外膨壓的作用下，使游動孢子細胞破裂而死亡[46]。該屬的其他細菌如Lysobactersp.strain SB-K88和L.enzymogenes3.1T8能產(chǎn)生抗生素，抑制瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)與螺殼狀絲囊霉(A.cochlioides)引起的猝倒病[51]。雖然這些抗生素的結(jié)構(gòu)尚未得到完全解析，但初步的研究表明，這些抗生素的拮抗機理是使F-actin(肌動蛋白)斷裂、游走孢子的超微結(jié)構(gòu)破壞、細胞壁水解和包囊萌發(fā)受抑制等[44]。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，L.enzymogenesOH11可以產(chǎn)生一種黃色素的抗生素使其菌落顏色呈黃色，這些黃色素通過Ⅱ型聚酮合酶(PKS)合成，是細菌賴以生存的遮光劑[52]。

此外，L.enzymogenesC3可以誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生對鐮刀菌引起的赤霉病的抗性，對根腐離蠕孢孢子的萌發(fā)和葉點病也有很好的防治作用[53]。最新的研究顯示，L.enzymogenesC3有許多分泌物能引發(fā)動物和植物病原菌G+的三型分泌系統(tǒng)[26]，該系統(tǒng)參與調(diào)控L.enzymogenesC3在靶標(biāo)真菌菌絲上的有效附著[54]，但其機制相對復(fù)雜，尚有待進一步闡明。雖然對該屬少數(shù)細菌的抑菌機理已有初步了解，但大部分抑菌物質(zhì)的代謝途徑及其詳細的抑菌機制仍不明確，還需深入研究。

7 溶桿菌屬細菌對線蟲的生物防治作用

線蟲體壁主要由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物組成，卵殼主要由膠原質(zhì)狀的蛋白圍繞脂蛋白所組成，而溶桿菌屬大部分菌株能分泌幾丁質(zhì)酶和蛋白溶解酶，故溶桿菌屬細菌對線蟲引起的病害能起到高效的防治作用。L.enzymogenesOH11對南方根結(jié)線蟲(M.incognita)的2齡幼蟲及其卵化有強烈的抑制作用[46]。L.enzymogenesC3對爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)的卵化無抑制作用，但對γ-輻照的卵能起到破壞作用，主要作用機制是細菌可以降解線蟲卵殼的幾丁質(zhì)層[54]。最近的研究顯示，L.enzymogenesC3和L.antibioticus能有效防治甜菜囊腫線蟲(HeteroderaschachtiiSchmidt)引起的白菜囊腫和大豆囊腫線蟲(Heteroderaglycines)引起的大豆囊腫，而且L.enzymogenesC3還可以殺死植物寄生的成年、幼年線蟲及培養(yǎng)的線蟲[23]。

8 溶桿菌屬的生物安全性及應(yīng)用前景

應(yīng)用微生物菌劑進行生物防治之前必須經(jīng)過嚴格的風(fēng)險評估，應(yīng)權(quán)衡其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對環(huán)境危害的風(fēng)險系數(shù)，以確定該生物菌劑對人體是否有害。溶桿菌屬就是一個很好的例子，其在環(huán)境中有很高的豐度，且是自然種群，很難受到人為控制。因此，在使用溶桿菌屬細菌進行生物防治之前，一定要先進行嚴格的風(fēng)險評估[3]。

Christensen等[1]研究表明，溶桿菌屬具有獨特的滑動性和溶菌活性，這些屬性使得溶桿菌屬細菌在生物防治病原菌和線蟲方面具有很強的優(yōu)勢。目前使用的對溶桿菌屬細菌的詳細介紹主要是2001年Christensen的描述。隨著溶桿菌屬新種不斷被發(fā)現(xiàn)，對其描述需要大量修改，而且溶桿菌屬細菌的一些特殊特征需要通過不同種之間的差異性進行分析，所以必須基于DNA的檢測方法，結(jié)合選擇性培養(yǎng)才能更深入地了解溶桿菌屬細菌的形態(tài)特征、棲息地和多樣性[27]。

溶桿菌屬高效、廣譜的拮抗作用具有誘人的應(yīng)用前景，現(xiàn)已成為植物病害生防微生物的重要組成部分，但與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等其他生防菌相比，其研究還處于起步階段，對溶桿菌屬相關(guān)抗菌物質(zhì)及其抗菌機理尚不甚了解。近年來，現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)特別是分離純化、波譜學(xué)等技術(shù)的突破，為溶桿菌屬的進一步研究提供了強有力的技術(shù)手段。因此，今后應(yīng)該從以下方面加強研究：首先，溶桿菌屬細菌數(shù)量很多，已發(fā)現(xiàn)的數(shù)量相對較少，需深入發(fā)掘具有廣譜抗菌性的新細菌，并在評價其安全性的基礎(chǔ)上，研究其生防潛力、作用機制，發(fā)掘其具有巨大生防前景的活性分子。其次，需深入研究已發(fā)現(xiàn)的具有顯著抗菌活性的小分子物質(zhì)的抑菌機理。陜西師范大學(xué)藥用植物資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室在遠志根際分離得到1株菌株，經(jīng)鑒定其為溶桿菌屬細菌，并命名為L.yananisissp.nov.[27]；經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，其胞外抗菌物質(zhì)主要為蛋白類，在建立該菌胞外和胞內(nèi)蛋白雙向電泳圖譜的基礎(chǔ)上[55]，進一步分離得到了枯草桿菌蛋白酶、α水解蛋白酶和β水解蛋白酶3種具有抑菌活性的蛋白質(zhì)，其抑菌效果更強的小肽類物質(zhì)正在分離純化中。同時研究還發(fā)現(xiàn)，L.yanansis細菌具有較好的定殖能力，能在玉米根部表皮和韌皮部定殖，這為L.yanansis細菌生物防治機理的研究和開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)(相關(guān)結(jié)果另文發(fā)表)；此外，利用誘變育種、原生質(zhì)融合及轉(zhuǎn)化技術(shù)對菌株進行改良，以提高菌株的抑菌能力；加強細菌活性物質(zhì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，使其規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化，從而推動其從實驗室和溫室的小規(guī)模研究向大田試驗邁進。

[1] Christensen P,Cook F D.Lysobacter,a new genus of nonfruiting,gliding bacteria with a high base ratio [J].International Journal of Systematic and Bacteriology,1978,28(3):367-393.

[2] Bae H S,Im W T,Lee S T,et al.Lysobacterconcretionissp.nov,isolated from anaerobic as granules in an upflow anaerobic sludge blanket reactor [J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2005,55(3):1155-1161.

[3] Hayward A C,Fegan N,Fegan M,et al.Stenotrophomonas andLysobacter:Ubiquitous plant-associated gamma-proteobacteria of developing significance in applied microbiology [J].Journal of Applied Microbiology,2010,108(3):756-770.

[4] Weon H Y,Kim B Y,Baek Y K,et al.Two novel species,Lysobacterdaejeonensissp.nov.andLysobacteryangpyeongensissp.nov.,isolated from Korean greenhouse soils [J].International Journal of Systematic and Bacteriology,2006,56(5):947-951.

[5] Tindall B J,Euzeby J P,Vaughan,et al.Lysobacterenzymogenessubsp.enzymogenes Christensen and Cook 1978,L.enzymogenessubsp.cookii Christensen 1978 and Streptococcus casseliflavus(Mundt and Graham 1968) 1978 should have been cited in the approved lists of bacterial names request for an opinion [J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2006,56(11):2707-2709.

[6] Lee J W,Im W T,Kim M K,et al.Lysobacterkoreensissp.nov.,isolated from a ginseng field [J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2006,56(1):231-235.

[7] Yassin A F,Chen W M,Hupfer H,et al.Lysobacterdefluviisp.nov.,isolated from municipal solid waste [J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2007,57(5):1131-1136.

[8] Weon H Y,Kim B Y,Kim M K,et al.Lysobacterniabensissp.nov.andLysobacterniastensissp.nov.,isolated from greenhouse soils in Korea [J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2007,57(3):548-551.

[9] Romanenko L A,Uchino M,Tanaka N,et al.Lysobacterspongiicolasp.nov.,isolated from adeep-sea sponge [J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2008,58(2):370-374.

[10] Park J H,Kim R,Aslam Z,et al.Lysobactercapsicisp.nov.,with antimicrobial activity,isolated from the rhizosphere of pepper,and emended description of the genusLysobacter[J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2008,58(2):387-392.

[11] Aslam Z,Yasir M,Jeon C O,et al.Lysobacteroryzaesp.nov.,isolated from the rhizosphere of rice (OryzasativaL.) [J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2009,59(4):675-680.

[12] Srinivasan S,Kim M K,Sathiyaraj G,et al.Lysobactersolisp.nov.,isolated from soil of aginseng field [J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2010,60(7):1543-1547.

[13] Wang Y,Dai J,Zhang L,et al.Lysobacterximonensissp.nov.,isolated from soil [J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2009,59(4):786-789.

[14] Ten L N,Jung H M,Im W T,et al.Lysobacterpanaciterraesp.nov.,isolated from soil of a ginseng field [J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2009,59(5):958-963.

[15] Ten L N,Jung H M,Im W T,et al.Lysobacterdaechenongensissp.nov,isolated from sediment of stream near the daechung dam in south korea [J].The Journal of Microbiology,2008,46(5):519-524.

[16] Liu M,Liu Y F,Wang Y Q,et al.Lysobacterxinjiangensissp.nov.,a moderately thermotolerant and alkalitolerant bacterium isolated from a gamma-irradiated sand soil sample [J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2011,61(2):433-437.

[17] Wei D Q,Yu T T,Yao J C,et al.Lysobacterthermophilussp.nov.,isolated from a geothermal soil sample in Tengchong,south-west China [J].Antonie van Leeuwenhoek,2012,102(4):643-651.

[18] Luo G S,Shi Z J,Wang G J,et al.Lysobacterarseniciresistenssp.nov.,an arsenite-resistant bacterium isolated from iron-mined soil [J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2012,62(7):1659-1665.

[19] Hae-Min J,Ten L N,Im W T,et al.Lysobacterginsengisolisp.nov.,a novel species isolated from soil in pocheon province,South Korea [J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2008,18(9):1496-1499.

[20] Wang G L,Wang L,Chen H H,et al.Lysobacterruisheniisp.nov.,a chlorothalonil-degrading bacterium isolated from a long-term chlorothalonil-contaminated soil [J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2011,61(3):674-679.

[21] Oh K H,Kang S J,Jung Y T,et al.Lysobacterdokdonensissp.nov.,isolated from soil [J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2011,61(5):1089-1093.

[22] Zhang L,Bai J,Wang Y,et al.Lysobacterkorlensissp. nov.andLysobacterbugurensissp.nov.,isolated from soil [J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology,2011,61(9):2259-2265.

[23] 姬廣海.溶桿菌屬及其在植物病害防治中的研究進展 [J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,26(1):124-130.

Ji G H.Advances in the study onLysobacterspp．bacteria and their effects on biological control of plant diseases [J].Journal of Yunnan Agricultural University,2011,26(1):124-130.(in Chinese)

[24] 都立輝,劉 芳.16S rRNA 基因在細菌鑒定中的應(yīng)用 [J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2006 (5):207-209.

Du L H,Liu F.Application of 16SrRNA gene in identification of bacteria [J].Journal of Dairy Science and Technology,2006(5):207-209.(in Chinese)

[25] Bosshard P P,Abels S,Zbinden R,et al.Ribosomal DNA sequencing for identification of aerobic gram-positive rods in the clinical laboratory(an 18-month evaluation) [J].Journal of Clinical Microbiology,2003,41(9):4134-4140.

[26] Kawamura1Y,Tomida J,Morita Y,et al.‘Lysobacterenzymo-genesssp.cookii’ Christensen 1978 should be recognized as an independent species,Lysobactercookiisp. Nov. [J].FEMS Microbiology Letters,2009,298(1):118-123.

[27] 胡蘇瑩.一株具有抗菌活性遠志根際細菌的鑒定及其代謝產(chǎn)物的研究 [D].西安:陜西師范大學(xué),2012.

Hu S Y.Research and identified the antibacterial activity ofPolygalarhizospherebacteria and their metabolites in plant [D].Xi’an:Shaanxi Normal University,2012.(in Chinese)

[28] 劉 波.微生物脂肪酸生態(tài)學(xué) [M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2011:5-19,163-168.

Liu B.Microbial ecology of fatty acid [M].Beijing:China Agricultural Science and Technology Press,2011:5-19,163-168.(in Chinese)

[29] 蔡妙英,洪俊華.應(yīng)用于細菌分類學(xué)中的DNA-DNA雜交方法 [J].微生物學(xué)通報,1984(1):40-42.

Cai M Y,Hong J H.DNA-DNA hybridization method used in bacterial taxonomy [J].Microbiology,1984(1):40-42.(in Chinese)

[30] 曾 靜,竇岳坦,王 磊,等.新疆地區(qū)鹽湖的中度嗜鹽菌16S rDNA全序列及DNA同源性分析 [J].微生物學(xué)報,2002,42(2):133-137.

Ceng J,Dou Y T,Wang L,et al.Analysis of the sequences 16S rDNA and DNA homology region of Xinjiang SalineLakemoderatelyhalophilicbacterium [J].Acta Microbiologica Sinica,2002,42(2):133-137.(in Chinese)

[31] Yi X,Xia Z J,Deng A H,et al.Isolation and identification of two xylanase producing extremely alkali tolerant strains ofBacillushaloduransfrom Turpan in China [J].Acta Microbiologica Sinica,2006,46(6):951-955.

[32] Guzman-Martinez A,Lamer R,VanNieuwenhze M S.Total synthesis of lysobactin [J].Journal of the American Chemical Society,2007,129(18):6017-6021.

[33] 朱 慧.產(chǎn)酶溶桿菌OH11菌株生防相關(guān)基因的克隆和表達 [D].南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué),1999.

Zhu H.Cloning and expression ofLysobacterenzymogenesstrain OH11 in biocontrol genes [D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,1999.(in Chinese)

[34] Postma J,Stevens L H,Wiegers G L,et al.Biological control ofPythiumaphanidermatumin cucumber with a combined application ofLysobacterenzymogenesstrain 3.1T8 and chitosan [J].Biological Control,2009,48:301-309.

[35] Folman L B,Postma J,Veen J,et al.Characterization ofLysobacterenzymogenes(Christensen and Cook 1978) strain 3.1T8,a powerful antagonist of fungal diseases of cucumber [J].Microbiological Research,2003,158(2):107-115.

[36] Folman L B,Postma J,Veen J,et al.Production of antifungal compounds byLysobacterenzymogenesisolate 3.1T8 under different conditions in relation to its efficacy as a biocontrol agent ofPythiumaphanidermatumin cucumber [J].Biological Control,2004,31(2):145-154.

[37] Li S,Jochum C C,Yu F,et al.An antibiotic complex fromLysobacterenzymogenesstrain C3:Antimicrobial activity and role in plant disease control [J].Phytopathology,2008,98(6):695-701.

[38] Palumbo J D,Yuen G Y,Jochum C C,et al.Mutagenesis of β-1,3-Glucanase Genes inLysobacterenzymogenesstrain C3 results in reduced biological control activity toward bipolaris leaf spot of tall fescue and pythium damping-off of sugar beet [J].Biological Control,2005,95(6):701-707.

[39] Ko H S,Jin R D,Krishnan H B,et al.Biocontrol ability ofLysobacterantibioticusHS124 against phytophthora blight is mediated by the production of 4-hydroxyphenylacetic acid and several lytic enzymes [J].Current Microbiology,2009,59(6):608-615.

[40] Tofazzal Islam M.Mode of antagonism of a biocontrol bacteriumLysobactersp.SB-K88 toward a damping-off pathogen aphanomyces cochlioides [J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2010,26(4):629-637.

[41] Brucker R M,Baylor C M,Walters R L,et al.The identification of 2,4-diacetylphloroglucinol as an antifungal metabolite produced by cutaneous bacteria of the salamander plethodon cinereus [J].Journal of Chemical Ecology,2008,34(1):39-43.

[42] Hashizume H,Hattori S,Igarashi M,et al.Tripropeptin E,a new tripropeptin group antibiotic produced byLysobactersp.BMK333-48F3 [J].The Journal of Antibiotics,2004,57(4):394-399.

[43] Vasilyeva N V,Tsfasman I M,Suzina N E,et al.Secretion of bacteriolytic endopeptidase L5 ofLysobactersp.XL1 into the medium by means of outer membrane vesicles [J].FEMS Microbiology Letters,2008,275(15):3827-3835.

[44] Au S,Roy K L,Tigerstrom von R G,et al.Nucleotide suence and caracterization of the gene for secreted alkaline phosphatase fromLysobacterenzymogenes[J].Journal of Bacteriology,1991,173(15):4551-4557.

[45] Qian G L,Hu B S,Jiang Y H,et al.Identification and characterization ofLysobacterenzymogenesas a biological control agent against some fungal pathogens [J].Agricultural Sciences in China,2009,8(1):68-75.

[46] 姜英華.一株新型生防菌菌株OH11的鑒定和生防效果的研究 [D].南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

Jiang Y H.Research a new strain of biocontrol bacterial strain OH11 identification and biocontrol effect [D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,2006.(in Chinese)

[47] 朱 慧,王云霞,胡白石,等.產(chǎn)酶溶桿菌OH11菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆與表達 [J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2008,24(2):136-141.

Zhu H.Wang Y X.Hu B S,et al.Cloning and expression ofLysobacterenzymogenesOH11 strain β-1,3-Glucanase gene [J].Jiangsu Journal of Agricultural Sciences,2008,24(2):136-141.(in Chinese)

[48] 劉軼儒,徐菲菲,錢國良,等.產(chǎn)酶溶桿菌rpfG基因的克隆與功能分析 [J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,36(2):45-50.

Liu Y R,Xu F F,Qian G L,et al.Cloning and functional analysis ofLysobacterenzymogenesrpfGgene [J].Journal of Nanjing Agricultural University,2013,36(2):45-50.(in Chinese)

[49] Li Y Y,Huffman J,Li Y,et al.3-Hydroxylation of the polycyclic tetramate macrolactam in the biosynthesis of antifungal HSAF fromLysobacterenzymogenesC3 [J].Medicinal Chem-istry Communications,2012,3(8):982-986.

[50] Zhang W,Li Y Y,Qian G L,et al.Identification and characterization of the anti-methicillin-resistantStaphylococcusaureusWAP-8294A2 biosynthetic gene cluster fromLysobacterenzymogenesOH11 [J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2011,55(12):5581-5589.

[51] Folman L B,Postma J,Van Veen J A,et al.Inability to find consistent bacterial biocontrol agents ofPythiumaphanidermatumin cucumber using screens based on ecophysiological traits [J].Microbial Ecology,2003,45(1):72-87.

[52] Wang Y,Qian G L,Li Y Y,et al.Biosynthetic mechanism for sunscreens of the biocontrol agentLysobacterenzymogenes[J].PLoS One,2013,8(6):e66633.

[53] Kobayashi D Y,Reedy R M,Palumbo J D,et al.Aclpgene homologue to theCrpgene family globally regulates lytic enzyme production,antimicrobial activity,and biological control activity expressed byLysobacterenzymogenesC3 [J].Applied and Environment Microbiology,2005,71(1):261-269.

[54] Chen J,Moore W H,Yuen G Y,et al.Influene ofLysobacterenzymogenesstrain C3 on nematodes [J].The Journal of Nematology,2006,38(2):233-239.

[55] 王斐斐,武坤毅,郭 玲,等.溶桿菌屬細菌Lysobacteryanansissp.nov.胞內(nèi)蛋白及胞外蛋白雙向電泳條件優(yōu)化及圖譜建立 [J].生物技術(shù)通報,2013(4):140-146.

Wang F F,Wu K Y,Guo L,et al.Optimization and construction of the intracellular and extracellular proteolulc map ofLysobacteryanansissp.nov. [J].Biotechnology Bulletin,2013(4):140-146.(in Chinese)

Advance in bacteria identification and biocontrol mechanism ofLysobacterspp.

WANG Na1,WU Kun-yi1,CUI Lang-jun1,ZHANG Hua-wei2

(1KeyLaboratoryofMedicinalPlantResourcesandNaturalPharmaceuticalChemistry(MinistryofEducation，SchoolofLifeSciences,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an，Shaanxi710062,China；2SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou,Zhejiang310014,China)

Widely attention has been paid toLysobacterspeciessince they can inhibit growth of pathogens.The distribution environment and typical biochemical characteristics of 26 reportedLysobacterspecies were analyzed and their phylogenetic tree was conducted based on 16S rDNA sequence similarity and fatty acid composition.DNA-DNA hybridization results were used as evidence.Then,the biological control of pathogenic bacteria and nematodes ofLysobacterspecies were discussed and the biosafety and application for biological control were introduced.

Lysobacter;bacteria identification;DNA-DNA hybridization;biological control

2013-12-13

國家自然科學(xué)基金項目(31101481)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費項目(GK261001237)

王 娜(1989-)，女，陜西寶雞人，碩士，主要從事藥用植物內(nèi)生菌的開發(fā)與利用研究。E-mail：shxwangna@163.com

崔浪軍(1977-)，男，陜西神木人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥用植物內(nèi)生菌的開發(fā)與利用研究。 E-mail：ljcui@snnu.edu.cn

時間:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.010

Q93-331

A

1671-9387(2015)05-0174-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.010.html