馬東方,劉署艷,方正武,巢凱翔,王保通,井金學(xué),張長青

(1 長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心,湖北 荊州 434025;2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 楊凌 712100;3 湖北省荊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院,湖北 荊州 434000)

華山新麥草易位系9020-17-25-6抗條銹病遺傳分析及細(xì)胞學(xué)鑒定

馬東方1,2,劉署艷3,方正武1,2,巢凱翔2,王保通2,井金學(xué)2,張長青1

(1 長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心,湖北 荊州 434025;2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 楊凌 712100;3 湖北省荊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院,湖北 荊州 434000)

【目的】 通過對華山新麥草與7182遠(yuǎn)緣雜交獲得的抗條銹病新種質(zhì)系9020-17-25-6進(jìn)行抗條銹病鑒定和遺傳分析，明確9020-17-25-6含有的抗病基因以及細(xì)胞學(xué)特性?！痉椒ā?在溫室內(nèi)以9020-17-25-6、感病對照銘賢169及其雜交后代F1、F2、F3和BC1群體為材料，采用我國目前流行的條銹菌生理小種CYR29、CYR30、CYR31、CYR32和CYR33對供試群體進(jìn)行苗期抗條銹性鑒定，分析抗病基因的遺傳規(guī)律，并利用基因組原位雜交(GISH)技術(shù)對9020-17-25-6含有的外源染色體片段進(jìn)行鑒定?！窘Y(jié)果】 9020-17-25-6在苗期對5個條銹菌生理小種均表現(xiàn)免疫或近免疫，其抗性可能來源于華山新麥草。9020-17-25-6對CYR32和CYR33的抗病性都是由1對顯性基因控制。GISH分析表明，9020-17-25-6含有來自華山新麥草的染色體或大的染色體片段，是一個普通小麥-華山新麥草易位系?！窘Y(jié)論】 華山新麥草易位系9020-17-25-6對我國目前流行的小麥條銹菌生理小種具有良好的抗病性，可以作為抗源在我國小麥抗銹育種中應(yīng)用。

小麥條銹病；華山新麥草；抗病基因；遺傳分析；易位系；原位雜交

小麥條銹病是由專性寄生菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)所引起的世界性小麥病害，該病害在我國西北、華北、長江中下游、西南等麥區(qū)普遍發(fā)生，對小麥生產(chǎn)具有全局性的影響[1-2]?；瘜W(xué)藥劑的大面積使用可以及時控制小麥條銹病，但要耗費(fèi)大量的人力、物力、財力，而且污染環(huán)境。國內(nèi)外大量的研究實(shí)踐表明，培育和種植抗條銹小麥品種是控制小麥條銹病最有效、環(huán)保的途徑[3]。但由于條銹菌的生理小種變異快、初始菌源量大，小麥主栽品種的抗感病程度不同或抗源的單一化導(dǎo)致條銹病常年大范圍發(fā)生和大區(qū)域流行[4-5]，這嚴(yán)重制約著我國糧食產(chǎn)量的穩(wěn)步增長。

至今，國際上已經(jīng)正式命名了62個抗條銹病新基因，以及數(shù)10個暫命名的基因，這些基因大部分表現(xiàn)小種?；訹6-7]。但是種植小種專化抗病性品種會加速條銹菌新小種的定向選擇[8-9]。自1950年以來，小麥品種的抗銹性經(jīng)歷了7次明顯的更替。這種現(xiàn)象也說明了我國目前使用的抗條銹小麥種質(zhì)資源十分有限[10-11]。因此，迫切需要尋找、鑒定、引進(jìn)新的抗條銹病小麥品種(系)，對其抗條銹的遺傳特點(diǎn)進(jìn)行研究，以便盡快增加抗病基因的多樣性，加快小麥持久抗病育種的進(jìn)程。

小麥的近緣植物中含有豐富的優(yōu)良抗病基因，尤其是小麥的三級基因庫具有普通小麥本身所沒有的遺傳特性，挖掘控制這些特性的基因?qū)Ω牧计胀ㄐ←湹目剐跃哂兄匾饬x。利用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)從小麥近緣種屬導(dǎo)入新的抗病基因到普通小麥，是實(shí)現(xiàn)小麥抗源多樣化的重要途徑[12-13]。已有小麥近緣植物與普通小麥雜交獲得小麥附加系、代換系和易位系，并培育出了一批含有外源基因的重要品種，如洛夫林13、貴農(nóng)22、小偃6號等品種[1]。華山新麥草(PsathyrostachyshuashanicaKeng)作為小麥的近緣種屬含有豐富的改良小麥種質(zhì)的優(yōu)異基因資源，育種專家已成功將華山新麥草的這些優(yōu)良基因?qū)肫胀ㄐ←溨?，用于小麥品種抗病性的改良[14-15]。華山新麥草易位系9020-17-25-6是由原西北植物研究所傅杰等采用遠(yuǎn)緣雜交結(jié)合胚胎拯救技術(shù)，以普通小麥7182為母本，華山新麥草為父本雜交選育而成。本研究利用我國流行的條銹菌生理小種對華山新麥草易位系9020-17-25-6進(jìn)行抗性鑒定、遺傳分析和細(xì)胞學(xué)分析，以明確9020-17-25-6是否攜帶小麥抗條銹病基因，并鑒定抗病基因來源以及細(xì)胞學(xué)特性，為進(jìn)一步利用華山新麥草中優(yōu)良抗條銹病基因提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

華山新麥草、普通小麥7182、易位系9020-17-25-6、感病對照品種銘賢169，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院抗病遺傳研究室提供。以銘賢169為母本，與9020-17-25-6進(jìn)行雜交獲得F1、F2、F3、BC1群體，分單株收獲。

條銹菌生理小種CYR29、CYR30、CYR31、CYR32和CYR33，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院抗病遺傳研究室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

親本、F1代各播20粒，每份F2代群體播種180粒、每份F3代家系播種20粒、每份BC1代播種40粒。所有供試小麥種子先用1%的雙氧水浸泡消毒，蒸餾水中浸種24 h，待其萌芽后播種在口徑為10 cm的小花盆內(nèi)，置于溫室中按常規(guī)方法培育。待小麥幼苗第1片葉子充分展開、第2片葉露尖時采用涂抹法接種第1片葉。先用手指蘸清水脫去小麥葉面蠟質(zhì)層，噴霧使葉面濕潤，然后用接種針蘸取條銹菌新鮮夏孢子懸浮液輕涂于葉片正面，接種后將麥苗放入保濕暗箱(溫度控制在10 ℃)中黑暗保濕(相對濕度100%)培養(yǎng)，24 h后取出，于溫室培養(yǎng)，溫度控制在15～17 ℃(晝)/10～12 ℃(夜)，每日光照15 h，光照強(qiáng)度729 mol/(m2·s)，相對濕度80%。

1.3 調(diào)查與統(tǒng)計分析

1.4 基因組原位雜交(GISH)

待種子根尖1～2 cm 時剪取根尖，在冰水中過夜后，用卡諾氏固定液固定24 h，45% 醋酸中壓片，液氮冷凍揭片，然后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫粺晒庠浑s交參照Chang等[17]的方法。通過缺口平移法采用地高辛(Roche,Germany)標(biāo)記華山新麥草總基因組DNA，以普通小麥中國春(CS)基因組DNA 為封阻。雜交后的載玻片加抗體地高辛-熒光素，然后用含適量碘化丙錠的抗褪色劑封片，熒光顯微鏡觀察染色體構(gòu)型，并用安裝CCD 相機(jī)的Penguin 150CL 照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 9020-17-25-6 苗期的抗性鑒定及抗性來源分析

以銘賢169為感病對照，用條銹菌生理小種CYR29、CYR30、CYR31、CYR32和CYR33對9020-17-25-6進(jìn)行苗期抗性鑒定，結(jié)果(表1)表明，9020-17-25-6對我國當(dāng)前條銹病流行小種均表現(xiàn)免疫或近免疫。因此，9020-17-25-6是一個抗小麥條銹病的優(yōu)良抗源。

為明確9020-17-25-6對小麥條銹病的抗性來源，用CYR29、CYR30、CYR31、CYR32和CYR33 5個小麥條銹菌生理小種對華山新麥草和7182進(jìn)行了苗期抗性鑒定，結(jié)果(表1)顯示，9020-17-25-6的抗病反應(yīng)型與華山新麥草相似，為免疫到近免疫(IT 0～0;)；而7182與銘賢169相似( IT 3+～4)。據(jù)此推斷，9020-17-25-6對條銹病的抗性可能來自于華山新麥草。

2.2 9020-17-25-6 苗期抗病性遺傳分析

用條銹菌生理小種CYR32、CYR33對9020-17-25-6、銘賢169以及9020-17-25-6與銘賢169雜交后代群體F1、BC1、F2、F3進(jìn)行抗性鑒定，結(jié)果(表2)顯示，所有雜交組合的F1代植株均表現(xiàn)抗病。接種CYR32的175株F2-1群體中，135株抗病，40株感病，抗感的分離比符合3∶1(χ2=0.32，P=0.51)；164株F2-2群體中，120株抗病，44株感病，抗感的分離比也符合3∶1；F1代與感病親本雜交的39株BC1代群體中，21株抗病，18株感病，抗感分離比符合1∶1 (χ2=0.10，P=0.63)；1個正交F3-1代家系(由F2-1獲得)中純抗家系、分離家系、純感家系的抗感分離比均符合1∶2∶1。結(jié)果表明，1對顯性基因控制9020-17-25-6對CYR32的抗病性。接種CYR33的163株F2-3群體中，124株抗病，39株感病,抗感的分離比符合3∶1(χ2=0.05，P=0.75)；BC1代群體的抗感分離比符合1∶1；1個正交F3-2代家系(由F2-3獲得)中純抗家系、分離家系、純感家系的抗感分離比均符合1∶2∶1。結(jié)果表明，1對顯性基因控制9020-17-25-6對CYR33的抗病性。

2.3 9020-17-25-6的細(xì)胞學(xué)特征

為明確9020-17-25-6 是否含有華山新麥草染色體片段，以華山新麥草總DNA 為探針，中國春基因組DNA 為封阻進(jìn)行了基因組原位雜交(GISH)，結(jié)果(圖1)顯示，9020-17-25-6 含有完整的42條小麥染色體，呈現(xiàn)PI 套染的紅色，并發(fā)現(xiàn)有1對染色體片段呈現(xiàn)黃綠色的外源DNA 雜交信號。這表明9020-17-25-6含有來自華山新麥草的染色體或大的染色體片段，是一個源于華山新麥草的小麥-華山新麥草易位系。

3 討 論

由于新的條銹菌小種不斷出現(xiàn)，使得國內(nèi)外的大量抗源及主栽小麥品種面臨抗病性喪失的威脅。華山新麥草與普通小麥的可雜交性好，二者的染色體具有相對穩(wěn)定的替換關(guān)系，存在于普通小麥的華山新麥草染色體可以穩(wěn)定遺傳[18]。因此利用含有抗條銹病基因的華山新麥草易位系選育強(qiáng)優(yōu)勢抗病小麥品種,是解決主栽小麥品種抗性喪失的新途徑。

根據(jù)西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院抗病遺傳課題組多年室內(nèi)和田間試驗(yàn)鑒定結(jié)果，易位系9020-17-25-6具有良好的全生育期抗病性。本研究對9020-17-25-6的抗條銹性鑒定結(jié)果表明，9020-17-25-6對我國目前流行的條銹菌小種具有優(yōu)良的抗病性，推測抗病基因可能來源于華山新麥草。對9020-17-25-6與感病品種銘賢169雜交的F2代群體接種CYR32和CYR33發(fā)現(xiàn)，其抗、感的分離比例符合3∶1的單顯性基因分離模式，說明衍生于華山新麥草的小麥新抗源9020-17-25-6對條銹病的抗性由1對顯性核基因控制。但該基因在9020-17-25-6染色體上的具體位置有待通過分子標(biāo)記進(jìn)一步確定。周新力等[13]的研究表明，小偃54可以作為高溫抗條銹基因的資源，之后Zhou等[16]在此基礎(chǔ)上對小偃54高溫抗條銹病基因進(jìn)行了定位，得到了與抗病基因緊密連鎖的標(biāo)記。姚強(qiáng)等[19]對小偃9323進(jìn)行了抗條銹基因的遺傳分析，之后唐明雙等[20]對小偃9323進(jìn)行了基因定位，得到了與抗病基因緊密連鎖的標(biāo)記。表明后續(xù)開展的基因定位工作對培育抗條銹小麥品種具有重要意義。

本研究GISH分析表明，9020-17-25-6含有來自華山新麥草的染色體或大的染色體片段，推測抗病基因來源于華山新麥草染色體。事實(shí)上，在小麥與華山新麥草的雜種后代中，這種既含有外源有利性狀但又有明顯的細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)改變的附加系和易位系已有報道[15,21]。9020-17-25-6外源染色質(zhì)的易位片段達(dá)到了整個染色體短臂，但是從農(nóng)藝性狀上與7182并無明顯區(qū)別，說明該短臂可能行使原來染色體臂上若干基因的功能，但其抗性基因整合到小麥染色體上的位置尚需進(jìn)一步研究。小麥易位系的選育既具有實(shí)際意義，又具有理論價值，易位系可以將供體種屬的一些優(yōu)良基因?qū)胧荏w小麥品種。本研究綜合運(yùn)用基因組原位雜交、抗病性鑒定等方法對9020-17-25-6進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，9020-17-25-6為農(nóng)藝性狀優(yōu)良的華山新麥草易位系，其抗病基因來源于華山新麥草，可作為培育小麥抗條銹病種質(zhì)的抗源，這對生產(chǎn)實(shí)踐和理論研究均有一定的利用價值。

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Cytological characterization and resistance inheritance of wheatPsathyrostachyshuashanicatranslocation line 9020-17-25-6

MA Dong-fang1,2,LIU Shu-yan3,FANG Zheng-wu1,2,CHAO Kai-xiang2, WANG Bao-tong2,JING Jin-xue2,ZHANG Chang-qing1

(1CollegeofAgriculture,EngineeringResearchCenterofEcologyandAgriculturalUseofWetlandMinistryofEducation,YangtzeUniversity,Jingzhou,Hubei434025,China;2StateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;3JingzhouAgricultureScienceAcademyofHubeiProvince,Jingzhou,Hubei434000,China)

【Objective】 The research was to study the inheritance of resistance to stripe rust in 9020-17-25-6,a wheat-Psathyrostachyshuashanicatranslocation germplasm line previously obtained from the interspecific hybridization of wheat genotype 7182 andPsathyrostachyshuashanica.【Method】 Five different races ofPucciniastriiformisf.sp.tritici(Pst),CYR29,CYR30,CYR31,CYR32 and CYR33,were selected to test the F1,F2,F3,and BC1progenies derived from 9020-17-25-6/Mingxian 169 at seedling stage in greenhouse.Genomic in situ hybridization (GISH) was applied to identifyP.huashanicachromosomes in 9020-17-25-6.【Result】 9020-17-25-6 was resistant to all tested Chinese races at seedling stage.Genetic analysis revealed that the resistance to CYR32 and CYR33 was controlled by a single dominant gene.A pair of signals was detected when using genomicP.huashanicaDNA as a probe in the GISH experiment,and the translocation alien chromatin in this line was very long and cytologically detectable,further indicating that 9020-17-25-6 was a wheat-translocation line.【Conclusion】 As a novel resistance resource,9020-17-25-6 had good resistance against popular rusts in China and it can be applied in wheat breeding for rust resistance．

wheat stripe rust;Psathyrostachyshuashanica;resistance genes;genetic analysis;translocation line;GISH

2014-06-06

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203032，201303008)；國家自然科學(xué)基金項目(31000846)；湖北省重點(diǎn)(優(yōu)勢)學(xué)科作物學(xué)(長江大學(xué))資助項目

馬東方(1984-),男,山東滕州人,博士,主要從事植物抗病遺傳研究。E-mail:madongfang1984@163.com

張長青(1962-),男,陜西楊凌人,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事小麥病害綜合防治研究。 E-mail:qingchangzhang@tom.com

時間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.033

S435.121.4+2

A

1671-9387(2015)01-0053-05

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