牛文斌,羅振國,程 亮,王春玲

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

AQP1基因沉默對前列腺癌PC-3細(xì)胞的影響①

牛文斌,羅振國,程 亮,王春玲

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探討水通道蛋白1(AQP1)基因沉默對在前列腺癌PC-3細(xì)胞的作用.方法：培養(yǎng)PC-3細(xì)胞至對數(shù)生長期，隨機(jī)分為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和質(zhì)?？瞻捉M。針對AQP1基因設(shè)計合成小片段RNA，并構(gòu)建高效表達(dá)載體。利用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PC-3細(xì)胞。RT-PCR檢測PC-3細(xì)胞AQP1mRNA的表達(dá)情況及激光共聚焦觀察室觀察、拍照AQP1表達(dá)的情況，轉(zhuǎn)染后72h。將鼠齡為6周的60只BALB/C-nu/nu雄裸鼠隨機(jī)分成兩組，其中正常對照組30只，轉(zhuǎn)染組30只。轉(zhuǎn)染組把轉(zhuǎn)染后的前列腺癌PC-3細(xì)胞注射裸鼠腋窩處皮下；對照組把未經(jīng)轉(zhuǎn)染的前列腺癌PC-3細(xì)胞注射到裸鼠腋窩處皮下。每日觀察腫瘤生長及體重情況，裸鼠飼養(yǎng)6周處死，完整取出移植瘤瘤體測量體積和重量。結(jié)果：與質(zhì)?？瞻捉M相比，轉(zhuǎn)染組應(yīng)用RNA干擾技術(shù)后AQP-1在前列腺癌PC-3細(xì)胞系中mRNA的水平降低，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組裸鼠移植瘤體積為(573．39±175．24)mm3明顯小于對照組(1482．50±327．86)mm3，P<0．05。轉(zhuǎn)染組腫瘤重量為(0．55±0．11)g明顯小于對照組(1．31±0．29)g，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。結(jié)論：AQP-1廣泛的表達(dá)在正常前列腺組織和前列腺癌組織中，對內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起著重要的作用。更多的AQP-1促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞的增長，抑制AQP-1的表達(dá)可以使前列腺癌移植瘤生長減慢，體積減小。

水通道蛋白1(AQP1);前列腺癌

居歐美國家第一位的前列腺癌有明顯的地區(qū)差異性和種族差異性[1]。在我國，近年因為老齡人口增多，同時各種先進(jìn)儀器設(shè)備的大量出現(xiàn)及診斷前列腺癌的方法不斷改進(jìn)，前列腺癌的發(fā)病率不斷增高[2]。在一些腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，水通道蛋白1(AQP-1)通過增加對水的通透性運(yùn)輸，促進(jìn)了腫瘤的生長及向周圍基質(zhì)浸潤[3]。以往的研究表明AQP1在前列腺癌組織中高表達(dá)[4]，為了研究和了解AQP1對前列腺癌細(xì)胞和實體瘤的影響，我們應(yīng)用RNAi干擾技術(shù)和裸鼠前列腺癌移植瘤模型，觀察了AQP1的高表達(dá)對前列腺癌PC-3細(xì)胞和移植瘤組織的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人前列腺癌PC-3細(xì)胞株(ATCC細(xì)胞系)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。實驗所用裸鼠品系為60只周齡6周體重均勻的BALB/C-nu/nu裸鼠，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)動物實驗中心的小鼠飼養(yǎng)隔離器內(nèi)。

1.2 前列腺癌PC-3細(xì)胞AQP1免疫組化檢測

人前列腺癌PC-3細(xì)胞按上海中科院細(xì)胞庫推薦的培養(yǎng)條件，使用含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況和細(xì)胞生長狀態(tài)等。待細(xì)胞融合度約70%時，吸出培養(yǎng)液。加入0.01MPBS( 以下所用的PBS相同)2mL，作用5min后吸出棄掉，重復(fù)洗片3次。之后加4%多聚甲醛1mL固定30min。再次用PBS洗3次，每次5min。棄掉PBS后加入1%BSA封閉液進(jìn)行封閉，室溫下作用30min后棄掉BSA封閉液，不用PBS清洗。每塊六孔板中3個孔加入200μL一抗(兔多克隆抗AQP1一抗，1：100倍稀釋)，另外3個孔對照組加等量抗體稀釋液，不加兔多克隆抗AQP1一抗。做好標(biāo)記，4℃過夜(或37℃孵育2h)。加一抗后的細(xì)胞及對照組細(xì)胞4℃過夜(或37℃孵育2h)后在室溫放置2h，0.01MPBS洗片3次，每次5min，避光條件下加入熒光(FITC)標(biāo)記羊抗兔IgG(熒光二抗, 1：50倍稀釋)，在室溫避光條件下放置2h后用0.01MPBS洗片3次，每次5min。做好以上步驟后，將板子里放點(diǎn)PBS，保存片子濕潤，不要干片，以免影響細(xì)胞形態(tài)。到激光共聚焦觀察室后，再將爬片取出，在干凈的載玻片上滴一滴50%的甘油，然后將爬片取出來倒扣在滴過甘油的載玻片上，顯微鏡下觀察、拍照。

1.3 RT-PCR 檢測 AQP1mRNA的表達(dá)

從前列腺癌PC3細(xì)胞系中提取總RNA, 應(yīng)用紫外分光光度計測定總RNA純度同時要計算其濃度，使用RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)AQP1在GenBank中的cDNA全長序列，使用PrimerPremier6.0軟件設(shè)計引物，引物由上海生工生物工程公司合成。進(jìn)入半定量PCR反應(yīng)體系,AQP1引物序列：上游:5′-GAAATCCCAACTCCAAAGAG-3′ ; 下游:5′-CAGCTAGACAATGATTTGGC-3 ′ , 擴(kuò)增長度為251bp;人β-actin引物: 上游: 5′-AGCGCAAGTACTCCGTGTG-3′ ;下游: 5′-AAGCAATGCTATCACCTCCC-3′,擴(kuò)增長度501bp;PCR反應(yīng)條件:95℃ 30s, 55℃ 30s,72℃ 40s, 擴(kuò)增30個循環(huán)。上下游引物分別用適量滅菌雙蒸水溶解至濃度為10pmol/μL。PCR反應(yīng)體系為cDNA模板1μL、AQP1上下游引物各0.5μL、人β-actin上下游引物各0.2μL。PCR產(chǎn)物在 2%瓊脂糖凝膠上電泳分析。

1.4 siRNA載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

重組質(zhì)粒構(gòu)建后經(jīng)DNA測序證實重組質(zhì)粒的序列與所設(shè)計序列完全一致，表明針對AQP1基因的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。應(yīng)用脂質(zhì)體將構(gòu)建好的CTD468-18超純質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的效率達(dá)到40%。采用Westernblot檢測AQP1蛋白在2組細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在位于28kD蛋白條帶位置2組細(xì)胞均呈現(xiàn)出AQP1特異性蛋白雜交條帶的表達(dá)，但亮度有明顯差異，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的蛋白條帶亮度明顯低于空白對照組。

1.5 裸鼠的飼養(yǎng)及腫瘤細(xì)胞的種植

裸鼠飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)動物實驗中心的小鼠飼養(yǎng)隔離器內(nèi),每日給予水、食物及12h陽光，觀察小鼠的生長狀況。取轉(zhuǎn)染72h的前列腺癌細(xì)胞及正常培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞，在離心管中加適當(dāng)胰酶消化后離心(1,000rpm，5min)，離心后去除培養(yǎng)液，檢測存活率90%以上后方可用于接種動物。用PBS將培養(yǎng)細(xì)胞調(diào)至密度4×107/mL，混勻的細(xì)胞懸液放入無菌Eppendorf管，并用封口膠密封，置入冰盒待用。為了保證各組細(xì)胞活力，收集好的細(xì)胞最好在 30min內(nèi)接種。6周齡雄性裸鼠60只，隨機(jī)分為兩組，每組30只，碘伏溶液消毒腋下穿刺點(diǎn)兩次。上下顛倒Eppendorf管以混勻細(xì)胞懸液，用注射器吸取細(xì)胞懸液。分別接種前列腺癌細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后的前列腺癌細(xì)胞。接種后，每天觀察裸鼠及腫瘤生長情況，42d后處死裸鼠，消毒手術(shù)小心完整剝離出皮下移植瘤。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18．0，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組數(shù)據(jù)之間比較用t檢驗, 多組均數(shù)間的顯著性檢驗使用方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AQP1在PC-3細(xì)胞的表達(dá)

激光共聚焦顯微鏡顯示AQP1在前列腺癌細(xì)胞表達(dá)，細(xì)胞膜及胞漿表現(xiàn)為綠色熒光，細(xì)胞核未著色，并且細(xì)胞形態(tài)各異，見圖1。轉(zhuǎn)染24h后熒光顯微鏡觀察：在熒光顯微鏡下，用紫外光激發(fā)，觀察到轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈紅色熒光，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不顯色，見圖2。

2.2 AQP1的RT-PCR產(chǎn)物的表達(dá)

經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外透射儀下在300bp左右可見明顯的特異產(chǎn)物帶。表明AQP1正常表達(dá)。同對照組相比轉(zhuǎn)染組表達(dá)減弱有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖1AQP1在前列腺癌PC-3細(xì)胞中表達(dá)×200

圖2 熒光顯微鏡下siRNA轉(zhuǎn)染的PC-3細(xì)胞×200

表1 AQP1 mRNA (PCR產(chǎn)物相對量)的表達(dá)(n=10)

注: 與對照組比較P<0.05。

2.3 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后PC-3細(xì)胞中AQP1蛋白的表達(dá)

細(xì)胞中AQP1蛋白的表達(dá)采用Westernblot方法檢測，結(jié)果顯示在位于28kD蛋白條帶位置均表現(xiàn)AQP1特異性蛋白雜交條帶的表達(dá)，但亮度有明顯差異，其中轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的蛋白條帶亮度明顯低于空白對照組(圖3)。

圖3WesternblotAQP1蛋白正常前列腺癌PC-3細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞表達(dá)。(1蛋白Maker,2正常前列腺癌PC-3細(xì)胞，3轉(zhuǎn)染后前列腺癌PC-3細(xì)胞)

2.4 檢測裸鼠皮下移植腫瘤生長，本實驗中,兩組裸鼠生命活動正常, 無一死亡(圖4～6)。與對照組相比，轉(zhuǎn)染組裸鼠移植瘤體積為(373．39±175．24)mm3明顯小于對照組(882．50±327．86)mm3，P<0．05。CMTM5組腫瘤重量為(0．55±0．11)g明顯小于對照組(1．31±0．29)g，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。

圖4 皮下種植前列腺癌細(xì)胞 圖5 皮下成瘤的裸鼠 圖6 取出腫瘤組織

3 討論

AQPs是家族性膜通道蛋白，能夠快速的介導(dǎo)水和一些小分子物質(zhì)通過。AQPs廣泛分布于機(jī)體的組織和器官，不同的組織和器官有不同的AQP分布，有時是多種AQP分布于同一器官，有利于維護(hù)組織器官的生理功能[5]。AQPs除了生理情況下調(diào)節(jié)微環(huán)境維護(hù)器官的生理功能外，病理情況下特別是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中起了重要的作用[6]，AQPs在前列腺癌中的分布和作用的初步研究表明AQP1在前列腺癌組織中高表達(dá)，抑制AQP1的表達(dá)可以抑制PC-3細(xì)胞的遷移[7]。AQP1大量表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜或許能夠改變腫瘤上皮內(nèi)的滲透壓，有助于腫瘤細(xì)胞體積及外形的改變，向周圍基質(zhì)浸潤[9]。前期試驗表明[8,4]與前列腺增生組織相比,AQP1高表達(dá)于前列腺癌組織中的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)及胞膜上，AQP1在組織中的高表達(dá)可以改變前列腺癌細(xì)胞和周圍環(huán)境滲透壓的變化進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖。但是AQP1在前列腺癌PC-3細(xì)胞中的不同水平表達(dá)情況及對前列腺癌PC-3細(xì)胞的影響還不清楚。

在本次實驗中運(yùn)用免疫組化和RT-PCR在不同水平檢測了前列腺癌PC-3細(xì)胞中AQP1的表達(dá)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照，可見前列腺癌細(xì)胞薄膜及胞漿被染成綠色，胞核未著色，證實AQP1主要表達(dá)于前列腺癌細(xì)胞膜和胞漿。

RNA干擾(RNAi)是通過雙鏈RNA分子介導(dǎo)的、同源mRNA高效特異性降解使相關(guān)基因表達(dá)減少或不表達(dá)的過程，屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默[10]。因為RNAi具有很高的特異性和高效率的特點(diǎn)，我們以AQP1基因為靶基因，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默AQP1基因，觀察AQP1基因沉默后其在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)變化情況和對前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，探討AQP1基因沉默對前列腺癌細(xì)胞的抗腫瘤作用，對研究前列腺癌的基因治療具有重要意義。本實驗針對AQP1mRAN序列設(shè)計合成siRNA,并成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒，用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入前列腺癌PC-3細(xì)胞，應(yīng)用Westernblot檢測AQP1蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的AQP1蛋白表達(dá)量顯著低于正常對照組，實驗結(jié)果表明RNAi質(zhì)粒載體的導(dǎo)入明顯抑制了前列腺癌PC-3細(xì)胞的AQP1蛋白表達(dá)，差異有顯著性(P<0.05)。為了進(jìn)步了解AQP1基因沉默對前列腺癌細(xì)胞移植瘤的影響以及影響機(jī)制，我們分別建立了AQP1基因沉默組和對照組的裸鼠移植瘤模型。實驗結(jié)果表明：AQP1基因沉默組裸鼠的移植瘤生長速度及體積明顯小于對照組，表明干擾AQP1的表達(dá)能夠抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

總之：我們檢測了前列腺癌PC-3細(xì)胞不同水平的AQP1表達(dá)情況，構(gòu)建和應(yīng)用RNA干擾(RNAi)干擾技術(shù)進(jìn)步明確了AQP1對PC-3細(xì)胞的影響。PC-3細(xì)胞的裸鼠移植瘤模型表明AQP1表達(dá)高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，阻斷或者抑制AQP1的表達(dá)能夠抑制移植瘤的發(fā)展，靶向抑制AQP1可能為前列腺癌的基因治療提供依據(jù)。

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黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題，編號：2009-328。

牛文斌(1972～)男，黑龍江佳木斯人，博士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事泌尿外科腫瘤研究。

王春玲(1975～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫(yī)師。E-mail:andylau1975@163.com。

R737.25

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1008-0104(2015)04-0141-03

2015-03-18)