付月君， 林桃桃， 梁愛華

（山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030006）

重組病毒Ac MNPV-BmK IT侵染Sf9細(xì)胞后凋亡相關(guān)基因的表達(dá)分析

付月君*， 林桃桃， 梁愛華

（山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030006）

將從東亞鉗蝎中克隆到的興奮型昆蟲毒素基因（BmK IT）同源重組到苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Ac MNPV）基因組中，得到重組病毒Ac MNPV-BmK IT，抗蟲試驗(yàn)表明重組桿狀病毒的殺蟲活性明顯優(yōu)于野生型病毒，但Ac MNPV介導(dǎo)的BmK IT的抗蟲分子機(jī)制尚未闡明。本試驗(yàn)從草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞中克隆獲得了凋亡相關(guān)基因Sfp53，制備了抗體，分析了Ac MNPV-BmK IT對(duì)Sfp53表達(dá)的影響，結(jié)果表明被重組病毒感染的細(xì)胞所表達(dá)的Sfp53時(shí)間與表達(dá)量與野生型相比都有所提前和提高，說明重組病毒可加速細(xì)胞的凋亡；同時(shí)通過半定量PCR分析了Ac MNPV-BmK IT感染Sf9細(xì)胞時(shí)病毒抗凋亡基因iap2的表達(dá)，結(jié)果表明重組型病毒抗凋亡基因iap2表達(dá)量減少。以上結(jié)果在細(xì)胞分子水平上解釋了Ac MNPV-BmK IT殺蟲活性提高的原因。

Ac MNPV-BmK IT； 凋亡；Sfp53；iap2

蝎使用其毒液作為狩獵和自衛(wèi)的武器，毒液的有效成分是一組由30～80個(gè)氨基酸組成的具有神經(jīng)毒性的多肽［1-2］。蝎神經(jīng)毒素按其作用對(duì)象大致可分為3類：哺乳動(dòng)物神經(jīng)毒素（MTx）、昆蟲神經(jīng)毒素和甲殼動(dòng)物神經(jīng)毒素（CTx）［3］。興奮型昆蟲神經(jīng)毒素的注入可以引起蟲體快速興奮性收縮麻痹［4］。本課題組將從東亞鉗蝎中克隆到的興奮型蝎昆蟲毒素基因（BmK IT）與苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californicamulticapsid nucleopolyhedrovirus，Ac MNPV）基因組同源重組，得到重組桿狀病毒Ac MNPV-BmK IT，BmK IT基因受極早期啟動(dòng)子IE1 promoter調(diào)控。接著，本課題組分別用重組桿狀病毒和野生型桿狀病毒感染棉鈴蟲幼蟲，結(jié)果表明，重組桿狀病毒的殺蟲活性明顯優(yōu)于野生型桿狀病毒，與Fan等［5］報(bào)道的結(jié)果一致。本研究通過檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和病毒抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來分析Ac MNPV介導(dǎo)的BmK IT的抗蟲分子機(jī)制。

細(xì)胞凋亡過程是對(duì)細(xì)胞死亡的調(diào)控，它不僅可以消除多余的正常細(xì)胞，也是一種抵抗外源基因的表達(dá)與病毒入侵的防御機(jī)制［6］。p53蛋白家族參與細(xì)胞周期調(diào)控、腫瘤的抑制、細(xì)胞的凋亡，其可分為無脊椎來源和有脊椎來源［7-9］。Ac MNPV的宿主草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）細(xì)胞中分離出來的Sfp53是一種與鱗翅目昆蟲同源的凋亡蛋白。Sfp53的過量表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，但其不會(huì)像黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）p53基因（Dmp53）那樣，受到UV或CPT（camptothecin）處理后，其內(nèi)源性的Sfp53也會(huì)增加［10］。在病毒基因組中，有兩種抗凋亡基因：p35與凋亡抑制基因iap（inhibitor of apoptosis）［11］。抗凋亡基因iap首先從蘋果蠹蛾顆粒體病毒CpGV（Cydia pomonella granulosis virus）和黃杉毒蛾核型多角體病毒Op MNPV（Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus）中被分離鑒定出來，它所編碼的蛋白可以抑制由p35缺失型重組病毒Ac MNPV所誘導(dǎo)的Sf21的凋亡［12-13］。

本試驗(yàn)從草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞中克隆獲得了凋亡蛋白Sfp53基因，構(gòu)建了pRSETc-Sfp53表達(dá)載體，利用Western blot分析了Ac MNPV-BmK IT對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白Sfp53的影響，同時(shí)通過半定量PCR分析了Ac MNPV-BmK IT感染Sf9細(xì)胞時(shí)病毒抗凋亡基因iap2的表達(dá)情況，從而為重組病毒Ac MNPV-BmK IT生物殺蟲劑的研發(fā)及明確其作用機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌種、質(zhì)粒、病毒

草地貪夜蛾細(xì)胞（Sf9）、大腸桿菌（Escherichia coli）XL10及野生型苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒Ac MNPV由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒p RSETc-BmK CT和Ac MNPV-BmK IT由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；p MD-18T購自TaKaRa公司。

1.2 主要工具酶及生化試劑

昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基TNM-FH（Sigma公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RNAisoTMPlus（TaKaRa公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit）、DNA限制性內(nèi)切酶（Thermo公司）；PCR擴(kuò)增所用EasyTaq酶、T4DNA連接酶和核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)（TransGen公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（Invitrogen公司）。

1.3 昆蟲Sf9細(xì)胞培養(yǎng)

將50.6 g TNM-FH粉末懸于1 L去離子水中，同時(shí)加0.35 g碳酸氫鈉，攪拌溶解，調(diào)節(jié)p H至6.2～6.4，使用滅菌的0.22μm濾膜濾器過濾除菌，配以50μg/mL慶大霉素備用。取出液氮中凍存的Sf9細(xì)胞，迅速置于27℃水浴中，待完全融化后1 000 r/min離心5 min，棄去上清液。細(xì)胞沉淀用含胎牛血清及抗生素的培養(yǎng)基懸浮，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)面積為25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基加至5 mL，于27℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 Sf9細(xì)胞總RNA的提取

將Sf9細(xì)胞接種于6孔板中，待長滿一層細(xì)胞時(shí)加入1 mL 1×PBS清洗細(xì)胞、再加入1 mL RNAisoTMPlus裂解細(xì)胞，用移液槍反復(fù)吹打細(xì)胞使其脫落，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中反復(fù)吹吸，直至裂解液中無明顯沉淀后室溫靜置5 min。向離心管中加入200μL氯仿，用力振蕩，待乳化溶液呈乳白狀（無分相現(xiàn)象）后室溫靜置5 min，12 000 g，4℃離心15 min。離心后勻漿液分為3層：無色的上清液、中間的白色蛋白層及下層有機(jī)相，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管，充分混勻后，在室溫下靜置10 min，12 000 g，4℃離心10 min，試管底部會(huì)出現(xiàn)白色沉淀，棄去上清液，沿離心管壁加入現(xiàn)配的75%冷乙醇l mL，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12 000 g，4℃離心5 min后小心棄去乙醇。室溫干燥沉淀至沒有乙醇?xì)埩簦尤脒m量的RNase-free水溶解沉淀，即得Sf9細(xì)胞總RNA。

1.4.2 cDNA第一鏈的合成

采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，以O(shè)ligo d T為引物，將總RNA中的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為：45℃1 h；70℃10 min；終止反應(yīng)。

1.4.3Sfp53基因的克隆

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索到的Spodoptera frugiperda p53 cDNA序列（GenBank accession No.HM773026.1），設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增Sfp53全長的引物（表1），酶切位點(diǎn)分別為XhoI和NheI（表1中下劃線標(biāo)出）。將cDNA模板稀釋10倍，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃30 s；53℃30 s；72℃90 s循環(huán)30次；72℃10 min。將PCR擴(kuò)增獲得的Sfp53基因構(gòu)建于克隆載體p MD18-T中，得到p MD18-T-Sfp53，經(jīng)測序確定其序列正確。

表1 PCR擴(kuò)增Sfp53和iap2基因所用引物及相關(guān)參數(shù)Table 1 The primer sequences and relative parameters for PCR amplification ofSfp53 andiap2 genes

1.4.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pRSETc-Sfp53的構(gòu)建

將p MD18-T-Sfp53用NheI和XhoI雙酶切后進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化得到目的基因Sfp53片段。分別用NheI和XhoI酶切表達(dá)載體pRSETc-BmK CT，切膠回收載體pRSETc。連接酶切后的表達(dá)載體pRSETc與Sfp53片段（圖1）。將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pRSETc-Sfp53送生工生物工程（上海）股份有限公司制備Sfp53抗體。

圖1 表達(dá)質(zhì)粒pRSETc-Sfp53的構(gòu)建流程Fig.1 Construction of the expression vector pRSETc-Sfp53

1.4.5 Western blot分析Ac MNPV-BmK IT感染Sf9細(xì)胞后Sfp53蛋白的表達(dá)

用含血清的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基（TNM-FH）將Sf9細(xì)胞稀釋為5×105個(gè)/mL，加2 mL到6孔板中。細(xì)胞培養(yǎng)板于27℃培養(yǎng)過夜，次日棄去舊培養(yǎng)基，依次加入無血清培養(yǎng)基（TNM-FH）、2.28×1012vp/ mL的Ac MNPV和Ac MNPV-BmK IT病毒分別感染細(xì)胞6、12、21、27、33、39、45 h，共設(shè)7個(gè)處理，每處理3次重復(fù)。提取細(xì)胞總蛋白，取5μL用BCA試劑測蛋白濃度，另取總蛋白與Loading buffer按5∶1混勻，金屬浴95℃5 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完畢將膠于轉(zhuǎn)膜槽中轉(zhuǎn)印1.5 h。轉(zhuǎn)印完畢，將PVDF膜用PBST清洗后，在封閉液中封閉1 h，期間緩慢搖動(dòng)。封閉后，將目的蛋白與標(biāo)準(zhǔn)分子量大小進(jìn)行比較，確定所需目的蛋白位置，剪下所需的膜，將膜用塑料膜封好，留下一小口以便加Sfp53抗體。將抗體稀釋2 000倍，從小口中加入，封好，置于4℃孵育過夜。用PBST洗去未結(jié)合的一抗，每次10 min，洗滌3次。將PVDF膜在辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗中孵育1 h（二抗稀釋比例為1∶6 000），再用PBST洗去未結(jié)合的二抗，每次10 min，洗滌3次。在暗室內(nèi)通過ECL試劑盒曝光顯影。

1.4.6 半定量PCR分析Ac MNPV-BmK IT感染Sf9細(xì)胞后抗凋亡基因iap2的轉(zhuǎn)錄水平

用有血清的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基（TNM-FH）將細(xì)胞稀釋為5×105個(gè)/mL，加2 mL到6孔板中，27℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。次日棄去舊培養(yǎng)基，依次加入無血清培養(yǎng)基（TNM-FH），濃度為2.28×1012vp/mL Ac MNPV和Ac MNPV-BmK IT病毒，感染細(xì)胞時(shí)間為36和60 h，每組3次重復(fù)。提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增iap2全長的引物，見表1。將cDNA模板稀釋10倍，測定cDNA濃度，保證模板初始量相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃30 s；51℃30 s；72℃1 min循環(huán)25次；72℃10 min。等體積PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，EB染色。通過BandScan軟件對(duì)條帶灰度進(jìn)行積分，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sf9細(xì)胞總RNA的提取及Sfp53基因的克隆

利用RNAisoTMPlus總RNA提取試劑盒提取Sf9細(xì)胞的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，可檢測到清晰的28S、18S和5S三條帶（圖2a），表明所提Sf9的總RNA完整。利用PrimeScriptTMRT Reagent Kit，以O(shè)ligo dT為引物合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，擴(kuò)增得1 125 bpSfp53序列（圖2b），經(jīng)測序證實(shí)擴(kuò)增目的條帶序列正確。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pRSETc-Sfp53的鑒定Fig.2 Analysis of recombinant plasmid pRSETc-Sfp53

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pRSETc-Sfp53的鑒定及Sfp53的抗體制備

根據(jù)方法1.4.4構(gòu)建好重組質(zhì)粒pRSETc-Sfp53，并進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定（圖2c，d），結(jié)果顯示質(zhì)粒構(gòu)建成功，質(zhì)粒經(jīng)測序證實(shí)構(gòu)建正確。將重組質(zhì)粒交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行制備抗體，獲得了Sfp53的多克隆抗體。

2.3 Western blot分析Ac MNPV-BmK IT對(duì)凋亡

蛋白Sfp53表達(dá)量的影響

如圖3a所示，重組Ac MNPV-BmK IT感染Sf9細(xì)胞12～33 h時(shí)，凋亡蛋白Sfp53的表達(dá)量增加，39 h以后Sfp53的表達(dá)量減少，說明在感染細(xì)胞12～33 h時(shí)細(xì)胞發(fā)生凋亡，39 h后細(xì)胞凋亡速度減慢，而野生型Ac MNPV感染細(xì)胞21 h后，凋亡蛋白Sfp53的表達(dá)量才有所增加且增加量不及重組型，感染45 h后Sfp53的表達(dá)量小幅度減少，說明野生型Ac MNPV感染Sf9細(xì)胞21 h后凋亡主要蛋白Sfp53才開始大量表達(dá)，且一直持續(xù)到45 h后，凋亡持續(xù)時(shí)間較長。重組型與野生型病毒處理組相比，前者誘導(dǎo)Sf9細(xì)胞的凋亡時(shí)間早，持續(xù)時(shí)間短，加速了細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。

圖3 Western blot分析AcMNPV-BmK IT對(duì)Sf9細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Sfp53表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Ac MNPV-BmK IT on the expression of apoptosis-related protein Sfp53 by Western blot assay

2.4 半定量PCR分析Ac MNPV-BmK IT感染Sf9細(xì)胞后抗凋亡基因iap2的轉(zhuǎn)錄水平分析

如圖4a所示，與野生型AcMNPV處理組相比，重組AcMNPV-BmK IT感染Sf9細(xì)胞后，病毒的抗凋亡基因iap2表達(dá)急劇減少，病毒的抗凋亡能力減弱，表明Sf9細(xì)胞凋亡被抑制程度減弱。經(jīng)t檢驗(yàn)，同一時(shí)間作用下各處理組之間P值小于0.01，差異極顯著，說明重組病毒抑制病毒的抗凋亡能力強(qiáng)，加速了宿主細(xì)胞的凋亡。

圖4 半定量PCR分析AcMNPV-BmK IT感染Sf9細(xì)胞對(duì)抗凋亡基因iap2轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.4 Effects of AcMNPV-BmK IT on the transcription level of the inhibitor of apoptosis geneiap2 by semi-quantitative PCR assay

3 結(jié)論與討論

病毒AcMNPV的復(fù)制可以引起Sf9細(xì)胞DNA的損傷，同時(shí)增加Sfp53的積累；抑制DNA的損傷可以阻止Sfp53的積累，但通過RNA干擾試驗(yàn)沉默Sfp53基因的表達(dá)并不影響AcMNPV的復(fù)制［14］。本試驗(yàn)表明，AcMNPV-BmK IT可以提高細(xì)胞中Sfp53的積累，推測是由于BmK IT通過調(diào)控Sf9細(xì)胞膜的鈉通道，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，從而增強(qiáng)了病毒的復(fù)制能力，提高了Sfp53的表達(dá)量，表明BmK IT不是從基因水平上影響細(xì)胞凋亡的調(diào)控，而是在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境上調(diào)控Sfp53蛋白的表達(dá)或積累，從而引起細(xì)胞凋亡，加強(qiáng)殺蟲能力的。

有結(jié)果顯示Ac MNPV感染Sf9細(xì)胞時(shí)可以引起凋亡抑制蛋白IAP表達(dá)量的降低，IAP下調(diào)也可以由病毒DNA的復(fù)制所觸發(fā)，其原因部分是由于某些蛋白酶的介導(dǎo)［15］。與野生型病毒處理組相比，Ac MNPV-BmK IT感染細(xì)胞時(shí)，iap2的表達(dá)得到抑制，推斷BmK IT通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境從而影響了病毒DNA的復(fù)制或凋亡，抑制蛋白IAP表達(dá)下調(diào)酶表達(dá)。本試驗(yàn)是從轉(zhuǎn)錄水平檢測iap2的表達(dá)，以后的工作還可開展IAP蛋白表達(dá)和IAP表達(dá)下調(diào)相關(guān)酶的檢測。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)桿狀病毒的IAPs可以阻斷Sf-caspase-1的激活［16］，本試驗(yàn)結(jié)果顯示重組病毒的iap2基因的表達(dá)大幅下調(diào)，這是由BmK IT引起的，下一步工作可分析這種下調(diào)對(duì)加速細(xì)胞凋亡的影響。

本文分析了重組病毒Ac MNPV-BmK IT侵染Sf9細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)Sfp53和病毒iap2的表達(dá)情況，為重組病毒Ac MNPV-BmK IT生物殺蟲劑的研發(fā)及作用機(jī)制研究提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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Expression analysis of apoptosis-related genes in Sf9 cells infected by recombinant AcMNPV-BmK IT

Fu Yuejun， Lin Taotao， Liang Aihua
（Institute of Biotechnology，Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering
of Ministry of Education，Shanxi University，Taiyuan030006，China）

We engineered an insect toxin gene fromButhus martensiiKarsch（BmK IT gene）into the genome of Ac MNPV（Autographa californicamulticapsid nucleopolyhedrovirus）in our previous study.The bioassay data indicated that the recombinant baculovirus Ac MNPV-BmK IT significantly enhanced the insecticidal activity.However，nothing is known about the apoptosis mechanism of Ac MNPV-BmK IT.In this study，Western blot and semi-quantitative PCR were used to analyze the effects of Ac MNPV-BmK IT on the expression of apoptosis-related genes，Sfp53 andiap2.The results showed that Ac MNPV-BmK IT increased the expression ofSfp53 and inhibited the expression ofiap2，which explained the enhanced insecticidal activity of Ac MNPV-BmK IT in cellular and molecular levels.

Ac MNPV-BmK IT； apoptosis；Sfp53；iap2

Q 781

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.004

2014 07 17

2014 09 01

國家自然科學(xué)基金（31272100）；山西省自然科學(xué)基金（2014011038-1）；山西省優(yōu)秀青年學(xué)術(shù)帶頭人支持計(jì)劃

*通信作者 Tel：0351 7011499，E-mail：yjfu@sxu.edu.cn