梁振普，劉雅靜，張小霞，李鵬娟，王 亮，張俊慶

(河南農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，河南 鄭州 450002)

桿狀病毒屬于桿狀病毒科(Baculoviridae)，是一類寄生于節(jié)肢動物(Arthropoda)的專一性病原微生物，其宿主主要是鱗翅目(Lepidoptera)、膜翅目(Hymenoptera)和雙翅目(Diptera)的昆蟲。已經(jīng)完成測序的基因組大小為80～180 kb不等，編碼89～181個開放閱讀框(ORF)[1]，被包裹在長度為230～385 nm、直徑為40～60 nm的桿狀核衣殼中[2-3]。目前已從800多種昆蟲中分離鑒定出600多種桿狀病毒[4]。桿狀病毒在其復雜的復制周期中產(chǎn)生2種不同類型的病毒粒子：出芽型病毒(Budded virus，BV)和包涵體型病毒(Occlusion-derived virus，ODV)[5]。2種病毒粒子在病毒感染過程中的作用存在明顯差異，BV是桿狀病毒在昆蟲體內傳播或在培養(yǎng)細胞中傳播所必需的，而ODV在桿狀病毒經(jīng)口感染宿主過程中發(fā)揮重要作用[6]。桿狀病毒可根據(jù)包涵體的形態(tài)特征分為2類：多角體病毒(Nucleopolyhedrovirus，NPV)和顆粒體病毒(Granulovirus，GV)[7]。NPV和GV形態(tài)存在明顯差異，NPV包涵體包埋多個病毒粒子，呈不規(guī)則多角體形狀，而 GV僅僅包埋1個病毒粒子，呈圓形或卵圓形。其中，NPV根據(jù)病毒粒子囊膜內核衣殼的數(shù)目又劃分為單粒包埋型核型多角體病毒(SNPV)和多粒包埋型核型多角體病毒(MNPV)。感染鱗翅目昆蟲的NPV又根據(jù)BV中是否含有GP64蛋白分為2類：Group Ⅰ和Group Ⅱ[8]。Group Ⅰ的NPV利用GP64作為BV的融合蛋白， 而Group Ⅱ的NPV由于缺少gp64基因，由F蛋白代替作為BV的融合蛋白。2006年Jehle等[9]基于基因組特征將桿狀病毒分為4個屬：α桿狀病毒屬(Alphabaculovirus，感染鱗翅目昆蟲的NPV)、β桿狀病毒屬(Betabaculovirus，感染鱗翅目昆蟲的GV)、γ桿狀病毒屬(Gammabaculovirus，感染膜翅目昆蟲的NPV)、δ桿狀病毒屬(Deltabaculovirus，感染雙翅目昆蟲的NPV)。

桿狀病毒殺蟲劑與傳統(tǒng)農(nóng)藥相比，有著宿主專一性強、環(huán)境兼容性好、對人畜無害、同時在環(huán)境中存活時間長等優(yōu)勢，是未來農(nóng)藥理想的發(fā)展方向[10]。除了在生物農(nóng)藥中的應用，昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應用于外源基因的表達，相對于原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)具有產(chǎn)物后加工好、成本低廉等優(yōu)點，因而廣泛應用于商業(yè)領域如生物醫(yī)藥、疫苗研發(fā)等方面。桿狀病毒除了以上2個方面的應用，還可以應用于哺乳動物基因轉移載體、表面展示系統(tǒng)以及病毒樣顆粒疫苗制備。鑒于此，綜述了桿狀病毒基因組學研究進展，以促進對桿狀病毒結構和功能的了解，為更好地開發(fā)和利用桿狀病毒提供借鑒。

1 桿狀病毒基因組

1.1 基因組特征

自從1994年Ayres等[11]報道苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)C6株的全基因組序列以來，隨著分子生物學技術手段的飛速發(fā)展，已有73種桿狀病毒全基因組被測定，包括45種α桿狀病毒、22種β桿狀病毒、1種δ桿狀病毒、3種γ桿狀病毒和2種未分類病毒(表1)。通過對不同桿狀病毒基因組比較發(fā)現(xiàn)，其基因組大小介于80～180 kb，G+C含量在29%～58%，全長大于50個氨基酸的ORF有89～181個。這些ORF幾乎均勻地分布在基因組DNA的2條鏈上，轉錄方向沒有偏好性，基因之間的基因間序列非常短，甚至基因之間有重疊。非編碼區(qū)占10%左右，主要由基因啟動子序列、基因上游或下游非編碼區(qū)和同源重復區(qū)(Homologous regions，hrs)組成。

表1 GenBank數(shù)據(jù)庫中已注冊的桿狀病毒基因組信息

續(xù)表1 GenBank數(shù)據(jù)庫中已注冊的桿狀病毒基因組信息

注：所有數(shù)據(jù)均來自https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesGroup.cgi? taxid =10442。

1.2 核心基因

盡管不同種桿狀病毒基因組存在基因組成的多樣性，但研究發(fā)現(xiàn)，有1套相對保守的基因存在于目前已測序的桿狀病毒基因組中。2012年Garavaglia等[12]研究發(fā)現(xiàn)37個桿狀病毒核心基因。2017年Javed等[13]報道了第38個核心基因pif7 (ac110)。目前，桿狀病毒的核心基因數(shù)目為38個，具體分類和名稱見表2。按照核心基因的功能可以分為五大類：復制，轉錄，包裝、裝配和釋放，口服感染，與宿主細胞相互作用。在核心基因編碼產(chǎn)物中，大約1/2是參與衣殼和ODV囊膜組成以及感染幼蟲所必須的蛋白質。其他大部分參與DNA的復制或加工，或者與晚期或極晚期轉錄有關。這些核心基因因其重要性在長期進化中得以保留，并成為桿狀病毒的重要標志[14]。隨著研究的深入也許會發(fā)現(xiàn)更多的核心基因，因為病毒許多共有的基因在進化過程中發(fā)生了突變而沒有被分析出來。

表2 桿狀病毒核心基因及分類

2 桿狀病毒功能基因組學

2.1 RNA轉錄相關基因

桿狀病毒基因組的轉錄表達是按時序進行的。根據(jù)桿狀病毒基因在病毒復制過程中的表達時間可分為極早期、早期、晚期和極晚期[15]。早期基因的合成依賴宿主RNA聚合酶Ⅱ識別和轉錄，而晚期基因則是病毒編碼的RNA聚合酶轉錄[16]。

轉錄活化因子IE-1與桿狀病毒基因組中的hrs相互作用形成二聚體，該二聚體可與宿主的轉錄系統(tǒng)相互作用從而促進早期基因的轉錄。桿狀病毒晚期基因利用的RNA聚合酶，由4個轉錄晚期和極晚期基因的亞基構成(LEF-4、LEF-8、LEF-9和P47)[16]。LEF-4是一種參與RNA加帽的酶。在LEF-8的C端發(fā)現(xiàn)很多物種RNA聚合酶的保守基序，它編碼RNA聚合酶的催化位點[17]。LEF-9存在與RNA聚合酶β亞基同源的基序，編碼酶活化中心Mg2+結合位點[18]。P47是RNA聚合酶中較小的亞基，與其他RNA聚合酶沒有同源性[19]。LEF-5和VLF-1也和晚期基因的轉錄相關。研究發(fā)現(xiàn)，LEF-5可與自身相互作用且C端含有一段與RNA聚合酶Ⅱ延長因子TFIIS類似的結構域。通過對LEF-5進行純化分析表明，LEF-5的功能是起始轉錄，而非延伸因子[20]。VLF-1與多角體蛋白和P10的轉錄相關。VLF-1與多角體和P10基因啟動子下游的“爆發(fā)序列”結合引發(fā)它們的大量表達[21]。其他與晚期基因表達有關的基因為lef-6、lef-10、lef-12和39k。此外，甲基轉移酶(Ac69)、ADP-核糖焦磷酸水解酶、LEF-2和PK1也可能參與了晚期基因的表達。

2.2 DNA復制相關基因

病毒DNA復制相關基因在病毒生命周期中起著關鍵的作用。桿狀病毒DNA的復制是由順式作用元件、反式作用因子及其宿主細胞提供的復制因子共同作用而完成的。順式作用元件是指病毒DNA復制起點，它包括同源重復序列和非同源重復序列2類。反式作用因子是病毒表達產(chǎn)物，該產(chǎn)物是病毒DNA復制所必需的。瞬時復制試驗證明，dna-pol、helicase(p143)、ie-1、lef-1、lef-2和lef-3是DNA復制的必需基因。IE-1是一種多功能調節(jié)蛋白，它能夠反式激活多個早期基因和晚期基因的啟動子，且其酸性激活區(qū)是病毒DNA復制所必需的[22]。LEF-1具有DNA引物酶活性，可與LEF-2相互作用[23]。LEF-2是一種DNA引物酶協(xié)助因子，也是DNA復制所必需的[24]。LEF-3是一種單鏈結合蛋白(SSB)，也可運送病毒DNA解旋酶進入宿主細胞核中[25]。P143是病毒編碼的DNA解旋酶，具有ATP酶和解旋酶的活性。dna-pol編碼了病毒的DNA聚合酶，具有3′—5′外切核酸酶活性。P35、IE-2、PE38、LEF-7、VLF-1作為激活因子刺激病毒DNA的復制。AN具有5′—3′核酸外切酶和核酸內切酶的活性，參與DNA的重組[26]。

2.3 主要結構蛋白基因

將桿狀病毒DNA轉染至相應細胞可以正常產(chǎn)生有感染性的子代病毒，病毒的復制和增殖并不受影響。因此，推測病毒結構蛋白對早期基因轉錄和病毒DNA復制并不是必需的[27]。桿狀病毒結構蛋白組成的復雜結構相當于一個將病毒基因組轉入宿主細胞中的運載系統(tǒng)，是通過對宿主昆蟲的長期適應進化演變而成的。有些結構蛋白還具有其他酶活性，能夠促進和幫助病毒在細胞內的復制。桿狀病毒產(chǎn)生的2種不同類型的病毒粒子BV和ODV，具有相同的核衣殼結構但囊膜組分不同(圖1)。表3詳細列出了桿狀病毒的主要結構蛋白基因，其主要編碼包涵體蛋白、BV和ODV的囊膜蛋白及核衣殼相關蛋白組分，其中后者大部分是BV和ODV共有的。

圖1 BV和ODV的結構與主要蛋白質構成

蛋白質分類基因名稱敲除后的影響包涵體蛋白polyhedrin可穩(wěn)定存在pe可穩(wěn)定存在enhancin可穩(wěn)定存在P10可穩(wěn)定存在alkaline proteasesBV囊膜蛋白gp64無法穩(wěn)定存在F-Protein可穩(wěn)定存在,但殺死幼蟲的時間延長V-ubiquitin可穩(wěn)定存在,但BV產(chǎn)量減少e26可穩(wěn)定存在ODV囊膜蛋白e26可穩(wěn)定存在e25無法穩(wěn)定存在ec43無法穩(wěn)定存在e18無法穩(wěn)定存在e66可穩(wěn)定存在vp91可穩(wěn)定存在ac145可穩(wěn)定存在,但經(jīng)口感染能力降低p74可穩(wěn)定存在,沒有經(jīng)口感染能力pif-1可穩(wěn)定存在,沒有經(jīng)口感染能力pif-2可穩(wěn)定存在,沒有經(jīng)口感染能力pif-3可穩(wěn)定存在,沒有經(jīng)口感染能力pif-4可穩(wěn)定存在,沒有經(jīng)口感染能力pif-5可穩(wěn)定存在,沒有經(jīng)口感染能力pif-6可穩(wěn)定存在,沒有經(jīng)口感染能力核衣殼相關蛋白p6.9無法穩(wěn)定存在vp39無法穩(wěn)定存在gp41無法穩(wěn)定存在38k無法穩(wěn)定存在p49無法穩(wěn)定存在ec27無法穩(wěn)定存在ac66受到嚴重影響 p33無法穩(wěn)定存在vp1054無法穩(wěn)定存在vlf-1無法穩(wěn)定存在vp80無法穩(wěn)定存在pp78/83無法穩(wěn)定存在p24可穩(wěn)定存在

3 桿狀病毒的應用

桿狀病毒的分子生物學研究促進了對病毒組裝及感染周期的認識，具有重要的理論意義，同時也具有重要的實踐意義。目前，桿狀病毒已廣泛用作生物殺蟲劑和外源蛋白表達載體。此外，桿狀病毒作為基因治療載體也越來越受到重視。

3.1 殺蟲劑

昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的研究始于19世紀。目前，已在20多個國家登記、生產(chǎn)和應用了近40種病毒殺蟲劑[28]。野生型桿狀病毒殺蟲劑具有對人畜和天敵無害、宿主特異性高、無化學殘留、對環(huán)境安全、可自然傳播等優(yōu)點。然而，桿狀病毒的殺蟲速度慢、殺蟲譜窄等缺點限制了其推廣。為了克服桿狀病毒的缺點，科學家開始嘗試用各種分子生物學手段進行改造以獲得重組桿狀病毒。近年來，該方面的研究主要集中在以下幾個方面：(1)缺失內源基因增加殺蟲效果。如將AcMNPV中的egt基因缺失，重組病毒會減少昆蟲的攝食，從而提高感染昆蟲的死亡率[29]。(2)插入外源基因提高殺蟲速度、降低害蟲對病毒的抗性。如插入昆蟲專性神經(jīng)毒素基因、昆蟲保幼激素酯酶基因、增效蛋白基因、蛋白酶基因、利尿激素基因等構建的重組病毒，大大縮短了害蟲的發(fā)病時間。(3)內源基因過量表達。如過量表達vfgf基因的重組AcMNPV明顯加速了寄主死亡[30]。(4)對宿主范圍基因操作來拓寬桿狀病毒宿主域。如將源自舞毒蛾核型多角體病毒(Lymantriadisparmultiple nucleopolyhedrovirus, LdMNPV)的hrf-1基因插入AcMNPV中，重組AcMNPV病毒可以在舞毒蛾細胞中復制[31]。隨著對重組病毒的深入研究，克服了桿狀病毒的缺點，也為增強病毒的殺蟲功能提供了可能。

3.2 表達載體

昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(Baculovirus expression system，BEVS)是基因工程四大表達系統(tǒng)之一，目前市場上商業(yè)化的桿狀病毒載體有Ac-Bacmid(來源于苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒基因組)和Bm-Bacmid(來源于家蠶核型多角體病毒基因組)[32-33]。它們在實際應用過程中具有產(chǎn)物表達水平高，表達產(chǎn)物可進行翻譯后加工，外源蛋白的免疫原性、抗原性和功能等生物活性與天然蛋白質相似，大規(guī)模生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品成本低等優(yōu)點。自1983年人們利用該表達系統(tǒng)首次成功表達人干擾素-β后，相繼成功表達了人生長因子、人2,6-唾液酸轉移酶、人粒-巨噬細胞集落刺激因子和人抗白蛋白免疫蛋白G1等蛋白[34-37]。目前，美國FDA(食品和藥物管理局)已經(jīng)授權上市9種BEVS來源的產(chǎn)品，其中Cervarix?、Provenge?、Glybera?和Flublok?疫苗分別用于預防和治療子宮頸癌、前列腺癌、脂蛋白酶缺乏遺傳病和流感；Porcilis?Pesti、BAYOVAC CSF E2?、Circumvent?PCV、Ingelvac CircoFLEX?和Porcilis?PVC主要用于預防豬疫病[38]。昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)可廣泛應用于生物學、醫(yī)學、農(nóng)業(yè)等不同領域表達蛋白質，為人類服務。

3.3 基因治療

基因治療是一種通過基因轉移載體將外源正?；驅氚屑毎约m正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫(yī)學技術。桿狀病毒相比于其他病毒轉移載體具以下優(yōu)點：(1)基因容量大，可容納1個或多個外源基因。(2)安全性高。由于桿狀病毒的天然宿主昆蟲是節(jié)肢動物，與人及其他哺乳動物的親緣關系較遠，即使它進入哺乳動物細胞，其基因組也不能在細胞中復制。(3)表達蛋白質效率高。桿狀病毒表達載體可同時攜帶多個啟動子，這些啟動子能各自驅動下游基因的高水平表達。(4)翻譯后修飾能力與哺乳動物細胞相似。因此，桿狀病毒在基因治療中具有廣闊的應用前景，開辟了桿狀病毒應用的新領域。目前桿狀病毒可用于治療多種疾病，包括癌癥、感染性疾病、遺傳性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等，其中癌癥治療是該技術的主要研究和應用領域[39]。

4 小結

隨著生態(tài)環(huán)保概念深入人心，昆蟲桿狀病毒將具有更大的發(fā)展前景，不僅為農(nóng)林生產(chǎn)提供新的生物農(nóng)藥，而且為研究宿主功能基因提供重要的基因工程載體[40]。桿狀病毒作為殺蟲劑，殺蟲速度慢和宿主域窄是其缺點，同時也是其優(yōu)點。殺蟲速度慢是因為病毒是一種簡單生命，要在蟲體內完成其復制周期，害蟲難以對其產(chǎn)生抗性；正是因為宿主域窄，所以它們對非靶標生物是安全的。在應用基礎研究上，可以針對具體情況構建重組型病毒或者添加殺蟲增效劑[41]。作為表達系統(tǒng)，其外源蛋白表達量低和蛋白質表達后修飾存在差異，也可以通過優(yōu)化表達系統(tǒng)進行完善。越來越多桿狀病毒基因組測序和功能基因研究的完成，為病毒殺蟲劑的開發(fā)提供了理論支持，也為深入了解桿狀病毒的侵染機制、分子進化和病毒與宿主的特異性互作關系提供重要的理論依據(jù)。