李 祥， 楊 真， 胡保文， 戴 勛， 董文霞

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物多樣性與病害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，云南省農(nóng)業(yè)生物多樣性利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗室，昆明 650201；2.紅塔煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，玉溪 653100）

研究報告

煙草葉片分泌物及植株揮發(fā)物釋放規(guī)律研究

李 祥1#， 楊 真1#， 胡保文2， 戴 勛2， 董文霞1*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物多樣性與病害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，云南省農(nóng)業(yè)生物多樣性利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗室，昆明 650201；2.紅塔煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，玉溪 653100）

煙草次生物質(zhì)不僅對多種害蟲的定向、產(chǎn)卵等行為具有調(diào)控作用，還能吸引天敵進(jìn)行間接防御。本研究利用溶劑漂洗法提取了煙草旺長期和成熟期的葉片分泌物，利用頂空吸附法收集了煙草旺長期植株的揮發(fā)物，并利用氣相色譜（GC）/質(zhì)譜（MS）聯(lián)用技術(shù)測定了煙草次生物質(zhì)的成分及含量。結(jié)果表明，煙草葉片分泌物中共檢測出36種化合物，其中旺長期有33種，成熟期有31種。煙草旺長期植株揮發(fā)物中共檢測出48種揮發(fā)物組分。其中36種組分的日周期釋放規(guī)律表現(xiàn)為隨光照加強(qiáng)和溫度升高，釋放量呈現(xiàn)上升趨勢；11：00－15：00時段的釋放量顯著高于其他各個時段（P＜0.05）。而其中9種組分表現(xiàn)為在夜間的釋放量顯著升高。

煙草； 溶劑漂洗法； 頂空吸附法； 次生物質(zhì)

昆蟲通常依靠自身的化學(xué)感受器與周圍環(huán)境中的化學(xué)信息產(chǎn)生關(guān)聯(lián)，為其尋找適宜的寄主植物，以達(dá)到最大程度的成功繁殖［1-2］。多數(shù)植食性昆蟲向寄主植物的遠(yuǎn)距離定向和降落過程中，其嗅覺起主導(dǎo)作用，所依賴的嗅覺信息正是植物體釋放的揮發(fā)性次生物質(zhì)［3-4］。接觸植物后，植食性昆蟲便對植物表面的非揮發(fā)性次生物質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征等做出評價，決定離開或進(jìn)行取食、產(chǎn)卵等行為［5］。

煙草（Nicotiana tabacumLinnaeus）是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。大量研究表明，煙草次生物質(zhì)不僅對煙夜蛾［Helicoverpa assulta（Guenée）］、棉鈴蟲［Helicoverpa armigera（Hübner）］、煙粉虱［Bemisia tabaci（Gennadius）］等昆蟲的定向、產(chǎn)卵等行為具有顯著的調(diào)控作用［6-9］，某些揮發(fā)性次生物質(zhì)還能吸引中紅側(cè)溝繭蜂［Microplitismediator（Haliday）］、棉鈴蟲齒唇姬蜂［Campoletis chlorideae（Uchida）］等天敵進(jìn)行間接防御［10-12］。煙草提取物對朱砂葉螨［Tetranychus cinnabarinus（Boisduval）］、小菜蛾［Plutella xylostella（Linnaeus）］等害蟲也具有一定的毒殺作用［13-15］。煙草上主要害蟲煙夜蛾、馬鈴薯麥蛾［Phthorimaea operculella（Zeller）］等都具有晝伏夜出的活動規(guī)律，De Moraes等的研究表明，煙草揮發(fā)物在不同時段的釋放差異，與其主要害蟲的為害習(xí)性有明顯的相關(guān)性［16］。

然而，關(guān)于煙草次生物質(zhì)的研究，至今尚未有全面系統(tǒng)的報道。已有的研究主要集中在揮發(fā)物的提取與鑒定［17-19］。關(guān)于揮發(fā)性較弱的葉片分泌物成分，以及煙草次生物質(zhì)在不同生育期和日周期不同時段的釋放規(guī)律至今未見報道。本研究利用氣相色譜（GC）/質(zhì)譜（MS）聯(lián)用技術(shù)測定了煙草次生物質(zhì)的組成，明確了煙草旺長期與成熟期葉片分泌物的成分差異，以及煙草旺長期植株揮發(fā)性物質(zhì)的成分及其日周期釋放規(guī)律，為今后探明煙草次生物質(zhì)與昆蟲間的作用機(jī)理以及從化學(xué)生態(tài)學(xué)角度進(jìn)行害蟲防治提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草品種為‘K326’，是我國各大煙區(qū)廣泛栽種的品種，煙草包衣種子由玉溪中煙種子有限責(zé)任公司提供。于2013年3月間在人工氣候箱（FLI2000H型，日本EYELA公司）內(nèi)采取漂浮育苗的方式進(jìn)行催芽，出芽后移栽至云南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室種植，于2013年6月進(jìn)行試驗。煙草生長期間不噴施任何農(nóng)藥，植株長勢良好。

1.2 方法

1.2.1 煙草不同生育期葉片分泌物的收集

溶劑漂洗法參照Udayagiri和Mason的方法［20］，并稍作改進(jìn)：試驗前1 d用蒸餾水洗凈試驗所需的葉片，并覆蓋保鮮袋。試驗時，于12：00從溫室剪取、稱量50 g健康的煙草旺長期和成熟期中部葉片，在4個存有50 mL二氯甲烷（色譜純，＞99.9%，天津四友）的燒杯中依次漂洗葉片5～10 s，將漂洗液用濾紙過濾2遍，加入癸烷和乙酸芐酯各2 000 ng作為內(nèi)標(biāo)，用氮吹法濃縮至2 mL，于－20℃冷藏待用。上述所有試驗操作均在冰盒中進(jìn)行，重復(fù)4次，取等量二氯甲烷重復(fù)以上過程作為空白對照。

1.2.2 煙草旺長期植株揮發(fā)物的收集

煙草旺長期植株揮發(fā)物的收集采用動態(tài)頂空吸附法。試驗時選取長勢良好、無病蟲害的旺長期植株6株，用保鮮膜和錫箔紙依次包裹土壤，在干燥潔凈的玻璃干燥器中靜置3 d，使其適應(yīng)系統(tǒng)環(huán)境。試驗前更換玻璃干燥器，并通氣10 min去除其中的氣味。玻璃干燥器上部通入兩根裝有吸附劑（700 mg Porapak Type Q，80～100 mesh，Waters）的巴斯德管，其中一根用Teflon管連接大氣采樣儀（QC-1S型，北京市勞動保護(hù)科學(xué)研究所）；另一根與活性炭相連接，作為凈化空氣的入口。收集時，控制空氣流量為600 mL/ min，連續(xù)吸附24 h，保持環(huán)境通風(fēng)、無異味，光源為自然光。收集完成后的樣品用2 mL正己烷（色譜純，＞98.0%，Merck）洗脫至棕色樣品瓶中，加入癸烷和乙酸芐酯各2 000 ng作為內(nèi)標(biāo)，用氮吹法濃縮至100μL，于－20℃冷藏待用。重復(fù)4次，系統(tǒng)為空白對照。4次重復(fù)所用煙草植株的總重量（不含根系）依次為337.68、309.44、284.80、318.36 g。

1.2.3 煙草旺長期植株不同時段揮發(fā)物的收集

試驗于2013年6月進(jìn)行，此時，昆明市05：30天色開始變亮，06：30天色完全變亮；19：30天色開始變暗，20：30天色完全變暗。揮發(fā)物日周期釋放規(guī)律試驗于以下5個不同時段進(jìn)行收集：A，06：30－10：30時段；B，11：00－15：00時段；C，15：30－19：30時段；D，20：30－00：30時段；E，01：00－05：00時段。每次試驗前更換新的收集裝置。收集方法參照1.2.2。4次重復(fù)所用煙草植株的總重量（不含根系）依次為94.53、113.62、109.76、99.67 g。

1.2.4 煙草葉片分泌物和植株揮發(fā)物組分的分離與鑒定

利用氣相色譜（GC）/質(zhì)譜（MS）聯(lián)用儀（Agilent 6890A/5973MS，美國Agilent公司）對煙草葉片分泌物和揮發(fā)物進(jìn)行分析，氫火焰離子檢測器FID，色譜柱為HP-5毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；程序升溫：起始溫度40℃，以3℃/min升溫至80℃，再以5℃/min升溫至260℃；柱前壓100 kPa，載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min，分流進(jìn)樣，分流比為10∶1，進(jìn)樣量2.0μL。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70eV，質(zhì)子掃描范圍35～500 amu，四級桿溫度150℃，離子源溫度230℃，傳輸線溫度250℃，柱壓100 kPa。通過核對標(biāo)準(zhǔn)譜庫（Wiley7n.l）與標(biāo)準(zhǔn)化合物的質(zhì)譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化合物的保留時間對提取物組分進(jìn)行定性分析；并通過峰面積歸一法和內(nèi)標(biāo)法對各組分進(jìn)行定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，利用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草不同生育期葉片分泌物的組成及含量

2.1.1 煙草不同生育期葉片分泌物的組成及含量

利用溶劑漂洗法從煙草葉片分泌物中共計檢測出36種化合物。其中旺長期葉片中共檢測出33

種，成熟期葉片中共檢測出31種。在煙草不同生育期葉片分泌物中均存在的化合物有28種。煙草旺長期葉片中特有的化合物為十三烷、十四烷、十五烷、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯、苯并噻唑；煙草成熟期葉片中特有的化合物為1-十八碳烯、十四烷酸、4-甲基苯乙酮（表1）。

煙草不同生育期葉片分泌物組分主要包括萜類、芳香族和脂肪族化合物；其中脂肪族化合物不僅含量較高，而且種類豐富，包括烴類、酸類、酰胺類、酯類和醛類化合物，其中以烴類化合物的含量最高（表1）。煙草從旺長期至成熟期間，其葉片分泌物總量呈上升趨勢，但兩者不存在顯著差異（P＞0.05）。隨著煙草的生長，葉片分泌物成分中，萜類、酸類化合物含量逐漸上升，芳香族、酯類化合物含量逐漸下降，在煙草旺長期和成熟期間存在顯著差異（P＜0.05）（表1）。煙堿在葉片分泌物所有組分中含量最高，也是變化量最大的物質(zhì)，在旺長期和成熟期時，其含量分別占提取物總量的15.00%和24.01%（表1）。

表1 煙草不同生育期葉片分泌物組成1）Table 1 Quantities of cuticular components of tobacco leaves during different growth stages

續(xù)表1 Table 1（Continued）

2.1.2 煙草不同生育期葉片分泌物中萜類和芳香族化合物的組成及含量

隨著煙草生長，萜類化合物的含量顯著升高（P＜0.05）。其中，1，5，9-三甲基-12-異丙基-4，8，13-環(huán)十四碳三烯-1，3-二醇為含量最高的萜類化合物，其旺長期和成熟期含量分別占提取物總量的14.09%和20.53%，從煙草旺長期至成熟期間顯著升高（P＜0.05）。降茄二酮在旺長期的含量是成熟期的2.18倍，是變化率最大的萜類化合物（表1）。

芳香族化合物的含量變化很大，成熟期葉片中的芳香族化合物含量僅為旺長期的31.12%。所鑒定出的4種芳香族化合物中，4-甲基苯乙酮僅存在于成熟期煙草葉片中；苯并噻唑僅存在于旺長期煙草葉片中。鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯是煙草葉片分泌物中含量最高的芳香族化合物，但僅存在于旺長期葉片分泌物中。鄰苯二甲酸二丁酯在不同生育期煙草葉片中均能檢測到，從旺長期到成熟期間，其含量約下降了（1 175.34±193.97）ng（表1）。

2.1.3 煙草不同生育期葉片分泌物中脂肪族化合物的組成及含量

從煙草不同生育期葉片分泌物中共鑒定出18種烴類化合物，旺長期葉片中含有17種化合物，成熟期葉片中僅含有15種化合物。除2，6，10-三甲基十五烷外，均為直鏈烷烴。十三烷、十四烷、十五烷僅存在于旺長期葉片中，其總量約占旺長期葉片中烴類化合物總量的17.17%。1-十八碳烯是唯一的不飽和烷烴，該物質(zhì)僅存在于成熟期葉片分泌物中。三十烷是含量最高的烴類化合物，占煙草葉片分泌物總量的10%左右。隨著煙草的生長，十六烷、十七烷、二十八烷、二十九烷的含量逐漸降低；壬烷、十八烷、二十五烷、二十六烷的含量逐漸升高，均在旺長期和成熟期間存在顯著差異（P＜0.05）（表1）。

4種酸類化合物均為直鏈烷酸，其中，亞油酸是唯一的不飽和烷酸。除十八烷酸外，另外3種酸類化合物的含量在旺長期和成熟期間變化顯著（P＜0.05）。十四烷酸僅存在于成熟期葉片分泌物中，約占提取物總量的0.78%。酰胺類化合物在煙草旺長期和成熟期葉片分泌物中含量較低，分別僅占提取物總量3.97%和4.23%。在旺長期至成熟期間，順-9-十八碳烯酰胺的含量表現(xiàn)為顯著升高；芥酸酰胺的含量表現(xiàn)為顯著降低（P＜0.05），但酰胺類化合物的總量在煙草旺長期和成熟期間無顯著差異（P＞0.05）（表1）。

2.2 煙草旺長期植株揮發(fā)物的組成及含量

2.2.1 煙草旺長期植株揮發(fā)物的組成及含量

利用頂空吸附法從煙草旺長期植株揮發(fā)物中共計鑒定出48種揮發(fā)物組分，其總量約為（82 047.52± 7 202.70）ng（表2）。主要包括綠葉氣味、萜類、芳香族和脂肪族化合物。其中，脂肪族化合物的含量較高，約占揮發(fā)物總量的41.39%，包括烴類、醛類、酸類、酮類、酯類和醇類化合物，其中烴類化合物的含量顯著高于其他類別的脂肪族化合物（P＜0.05）。萜類化合物和芳香族化合物含量較為接近，分別為（21 357.93±2 061.12）ng和（21 895.67±2 818.66）ng。綠葉氣味物質(zhì)的含量較低，不足揮發(fā)物總量的5%（表2）。

表2 煙草旺長期植株揮發(fā)物組成Table 2 Component quantities of volatile compounds from tobacco plants at vigorous growing stage

續(xù)表2 Table 2（Continued）

2.2.2 煙草旺長期植株中綠葉氣味、萜類和芳香族化合物的組成及含量

煙草旺長期植株揮發(fā)物中共鑒定出4種綠葉氣味物質(zhì)。其中，順-3-己烯-1-醇的含量占綠葉氣味物質(zhì)總量的一半以上，顯著高于其他組分（P＜0.05）。本研究共計鑒定出13種萜類化合物，其總量約占揮發(fā)物總量的26.03%。其中，新植二烯約占萜類化合物總量的42.79%，顯著高于其他組分（P＜0.05）。茄酮、香葉基丙酮、降茄二酮、α-柏木醇為含氧萜類化合物，約占萜類化合物總量的26.58%。煙草植株揮發(fā)物中芳香族化合物種類豐富，包括醛類、酮類、酚類、酯類和雜環(huán)類化合物等，其總量約為（21 895.67±281 8.66）ng。其中，2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚是揮發(fā)物中含量最高的化合物。苯并噻唑是僅有的含硫芳香族化合物，其含量不足揮發(fā)物總量的1%（表2）。

2.2.3 旺長期煙草植株中脂肪族化合物的組成及含量

從煙草旺長期植株揮發(fā)物中共鑒定出11種烴類化合物，均為飽和烷烴，約占脂肪族化合物總量的49.59%。其中，十五烷是含量最高的烴類化合物。醛類化合物的含量約占揮發(fā)物總量的7.57%，均為碳原子數(shù)相鄰的飽和直鏈烷醛，以癸醛含量最高，約占醛類化合物總量的49.46%。本研究僅鑒定出癸酸和十六烷酸2種酸類化合物，其含量分別為（1 339.63±118.83）ng和（3 440.45±301.15）ng；以及6-甲基-5-庚烯-2-酮和2，6-二叔丁基-2，5-環(huán)己二烯-1，4-二酮2種酮類化合物，其含量分別占揮發(fā)物總量的1.73%和3.99%。酯類和醇類化合物的含量極低，乙酸丁酯、異硫氰酸環(huán)己酯、2-乙基己醇的含量均不足揮發(fā)物總量的1%（表2）。

2.3 煙草旺長期葉片分泌物與植株揮發(fā)物的組成及含量分析

從煙草旺長期葉片分泌物和植株揮發(fā)物中分別鑒定出33種和48種化合物，均包含萜類、芳香族和脂肪族化合物。每單位質(zhì)量的樣品中，這幾類化合物在葉片分泌物中的含量均顯著高于植株揮發(fā)物（P＜0.05）。綠葉氣味物質(zhì)僅存在于植株揮發(fā)物中，未在葉片分泌物中檢測到（表1，表2）。

煙草旺長期葉片分泌物和植株揮發(fā)物共包含14種共有化合物。兩種不同提取方法所獲得的煙堿含量差異極顯著（P＜0.01），每單位質(zhì)量的樣品中，頂空吸附法所獲得的煙堿含量僅為溶劑漂洗法的1.37%。萜類化合物中的茄酮和降茄二酮在葉片分泌物中的含量顯著高于植株揮發(fā)物，但新植二烯在植株揮發(fā)物中的含量約為葉片分泌物中1.52倍。苯并噻唑和鄰苯二甲酸二丁酯為共有的芳香族化合物，溶劑漂洗法所獲得的這2種物質(zhì)的含量顯著高于頂空吸附法（P＜0.05）。兩種不同提取方法所獲得的提取物中，均包含壬烷、十三烷、十四烷等7種烴類化合物，分別占葉片分泌物中和植株揮發(fā)物中脂肪族化合物總量的22.68%和69.42%，占提取物總量的9.59%和14.31%。但是，每單位質(zhì)量的樣品中，溶劑漂洗法所獲得的這7種物質(zhì)的含量均顯著高于頂空吸附法（P＜0.05）。癸醛是唯一共有的醛類化合物，該物質(zhì)在植株揮發(fā)物中的含量約為葉片分泌物中的1.18倍（表1，表2）。

2.4 煙草旺長期植株日周期揮發(fā)物釋放規(guī)律

煙草旺長期植株揮發(fā)物所鑒定出的48種揮發(fā)物組分中，36種組分的日周期釋放規(guī)律表現(xiàn)為隨光照加強(qiáng)和溫度升高，釋放量呈現(xiàn)上升趨勢；11：00－15：00時段的釋放量顯著高于其他各個時段（P＜0.05）。5個不同時段的煙草植株揮發(fā)物釋放總量的變化趨勢與上述規(guī)律一致，其釋放量依次為（4 744.10±300.66）ng、（9 185.28±792.22）ng、（5 200.32±1 084.21）ng、（4 831.62±970.83）ng、（4 309.31±635.21）ng（圖1）。

圖1 煙草旺長期植株揮發(fā)物全日不同時段釋放總量Fig.1 Total amount of volatiles released from tobacco plants at vigorous growing stage during different periods in a day

煙草揮發(fā)物中，綠葉氣味物質(zhì)中的3-己醇、己醛、反-2-己烯醛、順-3-己烯-1-醇，脂肪族化合物中的壬烷、3-甲基癸烷、壬醛，萜類化合物中的α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、對-聚傘花素、反-羅勒烯這12種化合物釋放規(guī)律較為特殊，不遵循上述規(guī)律。其中，己醛在一天內(nèi)各時段的釋放量較為相似，以后半夜的釋放量較高，但在各個時段間不存在顯著差異（P＞0.05）。反-羅勒烯從日出時開始大量釋放，在日出至正午時段釋放量較高，顯著高于其他時段（P＜0.05）。由正午后開始，釋放量逐漸降低，在日出前降到最低。3-甲基癸烷在日出至正午時段的釋放量顯著高于其他時段（P＜0.05），但一天內(nèi)其他時段的釋放量之間不存在顯著差異（P＞0.05）。3-己醇、3-蒈烯、對-聚傘花素在進(jìn)入暗期后不久大量釋放，其釋放量顯著高于其他時段（P＜0.05）。α-蒎烯和β-蒎烯表現(xiàn)為進(jìn)入暗期后釋放量持續(xù)升高，且后半夜的釋放量顯著高于前半夜（P＜0.05）。順-3-己烯-1-醇、反-2-己烯醛、壬烷、壬醛也表現(xiàn)為進(jìn)入暗期后大量釋放，但在夜間2個時段間的釋放量不存在顯著差異（P＞0.05）（圖2）。

圖2 煙草旺長期植株揮發(fā)物組分全日不同時段釋放量Fig.2 The volatile compounds released from tobacco plants at vigorous growing stage during different periods in a day

3 討論

國內(nèi)外大量學(xué)者利用頂空吸附法［11，18，21-22］、水蒸餾法［9，17］、固相微萃取技術(shù)［19］對不同的煙草樣品及其制品進(jìn)行了研究，其中共有47種化合物與本研究的結(jié)果相一致。萜類化合物中α-胡椒烯、異長葉烯、α-柏木醇、黑松醇、1，5，9-三甲基-12-異丙基-4，8，13-環(huán)十四碳三烯-1，3-二醇這5種物質(zhì)，芳香族化合物中苯并噻唑、4-乙基苯乙酮、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯這4種物質(zhì)，脂肪族化合物中壬烷、3-甲基癸烷、2，6，10-三甲基十五烷、2，6，10，14-四甲基十五烷、癸酸、十七烷酸、亞油酸、乙酸丁酯、異硫氰酸環(huán)己酯、順-9-十八碳烯酰胺、芥酸酰胺、2-乙基己醇、十一烷醛、2，6-二叔丁基-2，5-環(huán)己二烯-1，4-二酮這14種物質(zhì)未見報道。推測這可能是由于收集的時間、方法及煙草的品種、部位等差異所導(dǎo)致。本研究中，葉片分泌物收集時采用的是離體煙草葉片，剪取時會對煙草造成一定的機(jī)械損傷，這可能會導(dǎo)致一些次生物質(zhì)的含量發(fā)生變化，甚至刺激植物體產(chǎn)生新的化合物。這也可能是導(dǎo)致本研究中植株揮發(fā)物和葉片分泌物的鑒定結(jié)果差異較大的原因之一。

本研究利用溶劑漂洗法和頂空吸附法從不同生育期煙草葉片和植株中共計提取到70種化合物。其中，煙堿揮發(fā)性較弱，由于收集方法的差異，導(dǎo)致其在煙草植株揮發(fā)物中檢測到的含量較低，但在煙草葉片分泌物中含量最高。綠葉氣味物質(zhì)通常在植物與昆蟲間的通訊中發(fā)揮重要的作用［23］。這類物質(zhì)主要通過植物體內(nèi)的茉莉酸由脂氧合酶途徑進(jìn)行合成和轉(zhuǎn)化［24］。綠葉氣味物質(zhì)沸點(diǎn)較低、易揮發(fā)，附著在葉片上的含量較少，由于收集方法的差異，導(dǎo)致其大量存在于頂空吸附法收集到的提取物中，而未能在溶劑漂洗法的提取物中檢測出。萜類化合物主要靠類異戊二烯途徑進(jìn)行合成與轉(zhuǎn)化［25］。本研究中，溶劑漂洗法收集到的萜類化合物的種類遠(yuǎn)低于頂空吸附法，這可能是由這些物質(zhì)的理化性質(zhì)差異所致。萜類化合物對于植物體的防御系統(tǒng)具有重要意義，多數(shù)萜類化合物不僅對植食性昆蟲具有驅(qū)避甚至是毒殺作用，還具有引誘天敵的通訊作用［26-27］。關(guān)于芳香族化合物的生物合成途徑報道較少，通常由L-苯丙氨酸作為起始分子，由莽草酸途徑進(jìn)行一系列的羥基化、甲基化等反應(yīng)形成各種芳香族化合物。這類物質(zhì)在植物體中主要作為香氣成分和結(jié)構(gòu)物質(zhì)［28］。付曉偉等的研究發(fā)現(xiàn)，寡食性的煙夜蛾對芳香族化合物能產(chǎn)生強(qiáng)烈的電生理反應(yīng)，但是廣食性的棉鈴蟲對這類物質(zhì)的響應(yīng)值則偏低［29］。因此可以認(rèn)為，煙草中的某些芳香族化合物對其主要害蟲可能具有一定的行為調(diào)控作用［8］。脂肪族化合物作為結(jié)構(gòu)性物質(zhì)，廣泛存在于各類植物體中。因而煙草植株揮發(fā)物和葉片分泌物中，脂肪族化合物均占了很大的比例。葉片表面蠟質(zhì)層上的弱揮發(fā)性烷烴類化合物通常被認(rèn)為是昆蟲近距離寄主定向、產(chǎn)卵行為等的信號物質(zhì)［20，30-31］。煙草旺長期時受蟲害較為嚴(yán)重，而葉片分泌物在旺長期和成熟期之間含量變化顯著的一些組分，很可能與一些害蟲的取食、產(chǎn)卵等為害行為相關(guān)。

許多植物揮發(fā)物的釋放存在晝高夜低的現(xiàn)象，表現(xiàn)為上午時釋放量迅速增加，中午時達(dá)到最大，然后在下午、晚上逐漸減少。這與溫度、光照以及植物體本身的生態(tài)生理特性相關(guān)［32-33］。此外，植物在由明轉(zhuǎn)暗時，某些揮發(fā)物的釋放會表現(xiàn)出一個短暫的暴發(fā)［34］。本研究中，煙草多數(shù)揮發(fā)物的釋放規(guī)律與之吻合。植物揮發(fā)物的釋放節(jié)律與植食性昆蟲日活動規(guī)律具有明顯的關(guān)聯(lián)性，植物體可通過調(diào)整自身某些揮發(fā)物的晝夜釋放規(guī)律來改變自身與昆蟲間的相互作用關(guān)系［35］。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)美國棉鈴蟲（Helicoverpa zeaBoddie）等夜蛾科昆蟲取食后的煙草能持續(xù)釋放特異性揮發(fā)物組分，并且晝夜釋放量差異顯著。其中，反-2-己烯醛、順-3-己烯-1-醇、3-己醇、己醛等綠葉氣味物質(zhì)，其夜間釋放量大的規(guī)律與夜蛾科昆蟲的活動規(guī)律相符合，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)夜間獨(dú)有的揮發(fā)物釋放組合是調(diào)控夜蛾科成蟲寄主選擇等行為的重要因素之一［16］。萜類化合物中，反-羅勒烯已被證明是煙夜蛾等多種蛾類定向與產(chǎn)卵的關(guān)鍵性物質(zhì)，并且可以協(xié)同其他化合物進(jìn)一步增強(qiáng)引誘效果［22，36］。研究發(fā)現(xiàn)，反-羅勒烯夜間釋放量的增加很可能是煙草防御機(jī)制的表現(xiàn)之一［37］。馬艷粉等的Y形嗅覺儀選擇試驗表明，α-蒎烯、β-蒎烯、p-聚傘花素、檸檬烯、壬醛等對煙草麥蛾等有顯著的引誘作用［38］。由此可以推測，本研究中反-2-己烯醛、壬醛、反-羅勒烯等具有特殊釋放規(guī)律的化合物很可能是調(diào)控昆蟲為害習(xí)性的關(guān)鍵性物質(zhì)。

鑒于植物與昆蟲間信息交流的復(fù)雜性，在明確煙草葉片分泌物和植株揮發(fā)物成分、含量及釋放規(guī)律的基礎(chǔ)上，今后可利用這些化合物進(jìn)行昆蟲電生理試驗，以及室內(nèi)生物測定和田間試驗等，以明確對某些特定昆蟲具有生理活性的組分，在此基礎(chǔ)上可開發(fā)出植物信息素引誘劑或者驅(qū)避劑等新型農(nóng)藥，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對部分害蟲的生態(tài)防控。

［1］ 欽俊德.昆蟲與植物的關(guān)系：論昆蟲與植物的相互作用及其演化［M］.北京：科學(xué)出版社，1987.

［2］ 欽俊德，王琛柱.論昆蟲與植物的相互作用和進(jìn)化的關(guān)系［J］.昆蟲學(xué)報，2001，44（3）：360 365.

［3］ Dethier V G.Mechanism of host-plant recognition［J］.Entomologia Experimentalis et Applicata，1982，31（1）：49 56.

［4］ Pickett J A，Wadhams L J，Woodcock C M.Insect supersense：mate and host location by insectsasmodel systems for exploiting olfactory interactions［J］.The Biochemist，1998，20（4）：8 13.

［5］ 孔垂華，婁永根.化學(xué)生態(tài)學(xué)前沿［M］.北京：高等教育出版社，2010：110 173.

［6］ 付曉偉，郭線茹，羅梅浩，等.煙夜蛾和棉鈴蟲對高濃度煙草揮發(fā)物的電生理和行為反應(yīng)［J］.昆蟲學(xué)報，2008，51（9）：902 909.

［7］ 林克劍，吳孔明，張永軍，等.B型煙粉虱觸角感受器的超微結(jié)構(gòu)及對寄主植物氣味的嗅覺行為反應(yīng)［J］.植物保護(hù)學(xué)報，2007，34（4）：379 384.

［8］ 劉婷，李為爭，游秀峰，等.常見植物揮發(fā)物對煙蚜的驅(qū)避和抑制定殖活性［J］.中國煙草學(xué)報，2013，19（2）：77 84.

［9］ 薛偉偉，付曉偉，羅梅浩，等.煙草揮發(fā)物對2近緣種夜蛾產(chǎn)卵行為的影響及其成分分析［J］.生態(tài)學(xué)報，2009，29（11）：5783 5790.

［10］Dong W X，Zhang Z N，F(xiàn)ang Y L，et al.Response of parasit-oidMicroplitis mediatorto plant volatiles in an olfactometer［J］.Insect Science，2000，7（4）：344 350.

［11］Yan Z G，Yan Y H，Wang CZ.Attractiveness of tobacco volatiles induced byHelicoverpa armigeraandHelicoverpa assultatoCampoletis chlorideae［J］.Chinese Science Bulletin，2005，50（13）：1334 1341.

［12］董文霞，張峰，方宇凌，等.煙蚜繭蜂對蚜蟲信息素及煙草揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2008，27（4）：591 595.

［13］白崇祿，丁玉梅，付亞麗，等.田間廢次鮮煙葉提取液的殺蟲效果研究［J］.云南農(nóng)業(yè)科技，2013（3）：4 7.

［14］丁吉林，丁偉，岑小惜，等.煙草粗提物對朱砂葉螨活性的初步研究［J］.煙草科技，2008（3）：63 64.

［15］王秀芳，任廣偉，王新偉，等.植物精油對煙草甲觸殺，熏蒸和驅(qū)避作用研究［J］.中國煙草學(xué)報，2011，17（2）：67 70.

［16］De Moraes C M，Mescher M C，Tumlinson J H.Caterpillarinduced nocturnal plant volatiles repel conspecific females［J］. Nature，2001，410：577 580.

［17］Andersen R A，Hamilton-Kemp T R，F(xiàn)leming P D，et al. Volatile compounds from vegetative tobacco and wheat obtained by steam distillation and headspace trapping［M］∥Parliment T H，Croteau R.Biogeneration of Aromas，1986：99 111.

［18］Andersen R A，Hamilton-Kemp T R，Loughrin J H，et al. Green leaf headspace volatiles fromNicotiana tabacumlines of different trichome morphology［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1988，36（2）：295 299.

［19］Clark T J，Bunch J E.Qualitative and quantitative analysis of flavor additives on tobacco products using SPME-GC-mass spectroscopy［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45（3）：844 849.

［20］Udayagiri S，Mason C E.Epicuticular wax chemicals inZea maysinfluence oviposition inOstrinia nubilalis［J］.Journal of Chemical Ecology，1997，23（7）：1675 1687.

［21］Leffingwell J C，Alford E D.Volatile constituents of perique tobacco［J］.Electronic Journal of Environmental，Agricultural and Food Chemistry，2005，4（2）：899 915.

［22］Sun J G，Huang L Q，Wang C Z.Electrophysiological and behavioral responses ofHelicoverpa assulta（Lepidoptera：Noctuidae）to tobacco volatiles［J］.Arthropod-Plant Interactions，2012，6（3）：375 384.

［23］Choudhary D K，Johri B N，Prakash A.Volatiles as priming agents that initiate plant growth and defence responses［J］. Current Science，2008，94：595 604.

［24］Matsui K.Green leaf volatiles：Hydroperoxide lyase pathway of oxylipin metabolism［J］.Current Opinion in Plant Biology，2006，9（3）：274 280.

［25］Tholl D.Terpene synthases and the regulation，diversity and biological roles of terpene metabolism［J］.Current Opinion in Plant Biology，2006，9（3）：297 304.

［26］Mumm R，Schrank K，Wegener R，et al.Chemical analysis of volatiles emitted byPinussylvestrisafter induction by insect oviposition［J］.Journal of Chemical Ecology，2003，29（5）：1235 1252.

［27］Mumm R，Tiemann T，Varama M，et al.Choosy egg parasitoids：Specificity of oviposition-induced pine volatiles exploited by an egg parasitoid of pine sawflies［J］.Entomologia Experimentalis et Applicata，2005，115（1）：217 225.

［28］Pichersky E，Noel JP，Dudareva N.Biosynthesis of plant volatiles：Nature’s diversity and ingenuity［J］.Science，2006，311（5762）：808 811.

［29］付曉偉，郭線茹，羅梅浩，等.兩近緣種夜蛾對低濃度煙草揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)［J］.生態(tài)學(xué)報，2009，29（6）：2962 2970.

［30］Li G Q，Ishikawa Y.Oviposition deterrents in larval frass of fourOstriniaspecies fed on an artificial diet［J］.Journal of Chemical Ecology，2004，30（7）：1445 1456.

［31］Li G Q，Ishikawa Y.Oviposition deterrents from the egg masses of adzuki bean borer，Ostrinia scapulalisand Asian corn borer，O.furnacalis［J］.Entomologia Experimentalis et Applicata，2005，115（3）：401 407.

［32］Holzke C，Hoffmann T，Jaeger L，et al.Diurnal and seasonal variation of monoterpene and sesquiterpene emissions from Scots pine（Pinus sylvestrisL.）［J］.Atmospheric Environment，2006，40（17）：3174 3185.

［33］Pio C A，Silva P A，Cerqueira M A，et al.Diurnal and seasonal emissions of volatile organic compounds from cork oak（Quercussuber）trees［J］.Atmospheric Environment，2005，39（10）：1817 1827.

［34］Chamberlain K，Khan Z R，Pickett J A，et al.Diel periodicity in the production of green leaf volatiles by wild and cultivated host plants of stemborer moths，Chilo partellusandBusseola fusca［J］.Journal of Chemical Ecology，2006，32（3）：565 577.

［35］戴建青，韓詩疇，杜家緯.植物揮發(fā)性信息化學(xué)物質(zhì)在昆蟲寄主選擇行為中的作用［J］.環(huán)境昆蟲學(xué)報，2010，32（3）：407 414.

［36］Hartlieb E，Rembold H.Behavioral response of femaleHelicoverpa（Heliothis）armigeraHB.（Lepidoptera：Noctuidae）moths to synthetic pigeonpea（Cajanus cajanL.）kairomone［J］.Journal of Chemical Ecology，1996，22（4）：821 837.

［37］Sánchez-Hernández C，López M G，Délano-Frier JP.Reduced levels of volatile emissions in jasmonate-deficientspr2 tomato mutants favour oviposition by insect herbivores［J］.Plant，Cell&Environment，2006，29（4）：546 557.

［38］馬艷粉，胥勇，肖春.10種寄主植物揮發(fā)物對馬鈴薯塊莖蛾產(chǎn)卵的引誘作用［J］.中國生物防治學(xué)報，2012，28（3）：448 452.

The release of leaf exudates and plant volatiles of tobacco

Li Xiang1， Yang Zhen1， Hu Baowen2， Dai Xun2， Dong Wenxia1
（1.College of Plant Protection，Yunnan Agricultural University；Key Laboratory of Agro-Biodiversity and Pest
Management of Education Ministry of China；Yunnan Key Laboratory of Agro-Biodiversity and
Conservation，Kunming650201，China；2.Hongta Group Co.，Ltd.，Yuxi653100，China）

Secondary metabolites released from tobacco manipulated the orientation and oviposition behaviors of pest insects and attracted natural insects to some pests.The major cuticular components of tobacco leaves were extracted by rinsing the leaves with dichloromethane and collecting tobacco plant volatiles by headspace absorption，and the components were analyzed by GC/MS.The results indicated that 36 compounds were identified from the tobacco leaves，33 compounds at vigorous growing stage，31 compounds at mature stage.Forty-eight volatile compounds were identified from tobacco plants at vigorous growing stage.The amounts of 36 compounds increased with the increase of temperature and sunlight，and the tobacco emitted high level of these volatile compounds at 11：00 15：00.However，the amounts of 9 compounds increased at night.

tobacco； leaf rinse with dichloromethane； headspace absorption； secondary metabolite

Q 946.8

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.003

2014 01 28

2014 03 07

致 謝：感謝中國科學(xué)院昆明植物研究所余珍老師在植物揮發(fā)物鑒定上給予的幫助。

*通信作者 E-mail：dongwenxia@163.com

#同等貢獻(xiàn)，并列為第一作者