付 偉，周赤忠，潘德銳

(湖北省武漢市普仁醫(yī)院，湖北 武漢 430081)

異丙酚改善氯胺酮誘發(fā)幼年大鼠腦損傷的蛋白組學(xué)研究

付 偉，周赤忠，潘德銳

(湖北省武漢市普仁醫(yī)院，湖北 武漢 430081)

目的探討異丙酚復(fù)合氯胺酮麻醉引起幼年大鼠海馬神經(jīng)元以及認(rèn)知功能損害后海馬組織蛋白組學(xué)的變化，了解異丙酚腦保護(hù)作用的機(jī)制。方法將出生后7d幼鼠80只隨機(jī)分為生理鹽水組、氯胺酮組、氯胺酮+異丙酚低劑量組、氯胺酮+異丙酚高劑量組，除生理鹽水組外，其余組均每隔2h給予相應(yīng)藥物腹腔注射1次，連續(xù)給藥3次后，每組處死10只大鼠進(jìn)行大腦海馬組織切片及海馬蛋白提取，應(yīng)用MALDI-TOF指紋圖譜檢測系統(tǒng)進(jìn)行蛋白組學(xué)差異研究。各組剩余的10只大鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，之后處死進(jìn)行海馬蛋白檢測。結(jié)果在3d時，氯胺酮組潛伏期顯著高于生理鹽水組，穿環(huán)次數(shù)顯著低于生理鹽水組；氯胺酮+異丙酚低劑量組和氯胺酮+異丙酚高劑量組潛伏期明顯低于氯胺酮組，氯胺酮+異丙酚高劑量組明顯低于氯胺酮+異丙酚低劑量組；氯胺酮+異丙酚低劑量組和氯胺酮+異丙酚高劑量組穿環(huán)次數(shù)顯著高于氯胺酮組, 氯胺酮+異丙酚高劑量組與生理鹽水組和氯胺酮+異丙酚低劑量組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。氯胺酮組海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)明顯高于生理鹽水組，氯胺酮+異丙酚低劑量組和氯胺酮+異丙酚高劑量組均明顯低于氯胺酮組，但氯胺酮+異丙酚低劑量組仍明顯高于生理鹽水組，氯胺酮+異丙酚高劑量組與生理鹽水組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。氯胺酮組海馬組織蛋白濃度明顯低于生理鹽水組，氯胺酮+異丙酚低劑量組和高劑量組與氯胺酮組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。氯胺酮+異丙酚組在末次給藥后檢測海馬組織蛋白，發(fā)現(xiàn)上調(diào)蛋白并鑒定為PD1A3、NDUFB10、HSPA8、ATP5JD、PSMA1、isoform-CRA-c，下調(diào)蛋白為PPIA、PKM2、GFAP、NSE、SYN1；21d后檢測結(jié)果表達(dá)上調(diào)蛋白為FUBP3、PRDX5，下調(diào)蛋白為GAPDH、AKR1A1、VCP、TUBULINA1B。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)初步篩選了異丙酚及氯胺酮麻醉后海馬組織蛋白的差異表達(dá),為預(yù)防和改善海馬神經(jīng)元變化后認(rèn)知功能損害提供了理論基礎(chǔ)。

異丙酚；大鼠腦；損傷；蛋白組學(xué)

氯胺酮是臨床常用的靜脈麻醉藥，鎮(zhèn)痛效果較好，呼吸抑制較輕，常用于兒科和全身基礎(chǔ)麻醉[1]。異丙酚常作為麻醉誘導(dǎo)劑,具有起效快、無蓄積、蘇醒完全等優(yōu)點(diǎn)[2]。許多研究表明氯胺酮麻醉可造成發(fā)育期腦損傷，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，而異丙酚具有腦保護(hù)作用，術(shù)后患者意識恢復(fù)迅速，并能夠減輕氯胺酮對幼兒神經(jīng)元的損傷，減輕認(rèn)知功能損害，但其具體機(jī)制尚不十分明確[3]。本實(shí)驗(yàn)采用雙向凝膠電泳蛋白分離手段和高效率蛋白質(zhì)譜鑒定技術(shù)，系統(tǒng)地分析了幼年大鼠用氯胺酮聯(lián)合異丙酚麻醉后海馬組織蛋白組學(xué)的變化，從而更深入了解異丙酚腦保護(hù)作用的機(jī)制，為臨床合理、安全使用靜脈麻醉藥物，特別是小兒靜脈麻醉提供理論指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動物 出生后7d的SD幼年大鼠80只，雌雄不拘，體質(zhì)量13～19 g，母幼鼠SPF飼養(yǎng)。

1.2主要試藥及器材 生理鹽水，異丙酚(北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，H20040300)，氯胺酮(山西金源通制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H14021800)；雙向凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)；蛋白考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。倒置相差顯微鏡，固相pH梯度等電聚焦儀，ETTAN ImageMaster 2D Elite 4.01凝膠圖像分析軟件，MALDT-TOF指紋圖譜檢測系統(tǒng)(Alllersham Pharmaeia Biotech公司)，Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1分組及模型建立 將80只SD幼鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、氯胺酮組、氯胺酮+異丙酚低劑量組、氯胺酮+異丙酚高劑量組，每組20只。異丙酚及氯胺酮配置濃度均為80 mg/kg。氯胺酮組給予氯胺酮1 mL腹腔注射麻醉，氯胺酮+異丙酚低劑量組給予氯胺酮1 mL+異丙酚0.5 mL腹腔注射麻醉，氯胺酮+異丙酚高劑量組給予氯胺酮1 mL+異丙酚1 mL腹腔注射麻醉，均每隔2 h給藥1次，連續(xù)給藥3次。

1.3.2樣品制備 麻醉結(jié)束后從各組隨機(jī)選10只幼鼠斷頭處死，迅速取出腦組織，分離皮質(zhì)取出海馬區(qū)，進(jìn)行石蠟包埋，制作石蠟切片，用于神經(jīng)元細(xì)胞凋亡檢測，并進(jìn)行海馬蛋白檢測。各組余下幼鼠麻醉結(jié)束后飼養(yǎng)21 d，進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，之后處死進(jìn)行海馬蛋白樣品制備：取新鮮腦組織，迅速分離皮層和海馬，用0～2 ℃蒸餾水清洗，并用濾紙吸取的多余水分，轉(zhuǎn)入液氮中保存。將樣本取出低溫勻漿，并加入裂解液提取總蛋白，蛋白樣品溶液小量分裝,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3檢測指標(biāo) 采用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡檢測；用2D Quant蛋白定量試劑盒測定總蛋白樣品的蛋白濃度；2-DE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)點(diǎn)，并采用MALDI-TOF指紋圖譜檢測系統(tǒng)及數(shù)據(jù)庫查詢及Wester-blot驗(yàn)證進(jìn)行蛋白差異定點(diǎn)鑒定。

2 結(jié) 果

2.1水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在3d時，氯胺酮組潛伏期顯著高于生理鹽水組(P<0.01)，穿環(huán)次數(shù)顯著低于生理鹽水組(P<0.01)；氯胺酮+異丙酚低劑量組和氯胺酮+異丙酚高劑量組潛伏期明顯低于氯胺酮組(P均<0.05)，氯胺酮+異丙酚高劑量組明顯低于氯胺酮+異丙酚低劑量組(P<0.05)；氯胺酮+異丙酚低劑量組和氯胺酮+異丙酚高劑量組穿環(huán)次數(shù)顯著高于氯胺酮組(P均<0.05), 氯胺酮+異丙酚高劑量組與生理鹽水組和氯胺酮+異丙酚低劑量組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：①與生理鹽水組比較，P<0.01；②與氯胺酮組比較，P<0.05；③與氯胺酮+異丙酚低劑量組比較，P<0.5。

2.2幼鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況 生理鹽水組海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)為(2.71±2.12)%，氯胺酮組為(14.98±5.65)%，氯胺酮+異丙酚低劑量組為(10.23±4.82)%，氯胺酮+異丙酚高劑量組為(6.79±6.48)%。氯胺酮組海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)明顯高于生理鹽水組(P<0.01)，氯胺酮+異丙酚低劑量組和氯胺酮+異丙酚高劑量組均明顯低于氯胺酮組(P均<0.05)，但氯胺酮+異丙酚低劑量組仍明顯高于生理鹽水組(P<0.05)，氯胺酮+異丙酚高劑量組與生理鹽水組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3幼鼠海馬組織蛋白濃度 生理鹽水組海馬組織蛋白濃度為(2.11±0.32)μg/μL，氯胺酮組為(1.78±0.28)μg/μL，氯胺酮+異丙酚低劑量組為(1.88±0.27)μg/μL，氯胺酮+異丙酚高劑量組為(1.93±0.21)μg/μL。氯胺酮組海馬組織蛋白濃度明顯低于生理鹽水組(P<0.05)，氯胺酮+異丙酚低劑量組和氯胺酮+異丙酚高劑量組與氯胺酮組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

2.4氯胺酮+異丙酚組不同時間點(diǎn)差異表達(dá)蛋白的上調(diào)及下調(diào)結(jié)果 末次給藥后檢測海馬組織蛋白，發(fā)現(xiàn)上調(diào)蛋白并鑒定為PD1A3、NDUFB10、HSPA8、ATP5JD、PSMA1、isoform-CRA-c，下調(diào)蛋白為PPIA、PKM2、GFAP、NSE、SYN1；21d后檢測結(jié)果表達(dá)上調(diào)蛋白為FUBP3、PRDX5，下調(diào)蛋白為GAPDH、AKR1A1、VCP、TUBULINA1B。

3 討 論

大腦中的海馬是神經(jīng)系統(tǒng)中參與認(rèn)知功能的重要組織[4]。NMDA受體是大腦中廣泛分布的受體，大腦皮質(zhì)和海馬中分布最多，而氯胺酮是NMDA受體的非競爭性拮抗劑，影響NMDA受體介導(dǎo)的CaMKs-ERK-EIKI/CREB-LTP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而影響機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶功能[5-6]；并且可通過下調(diào)NMDA受體通道亞單位NR2BmRNA的表達(dá)，改變NMDA受體的構(gòu)成從而損害認(rèn)知功能，可以通過誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的方式造成腦損害，從而導(dǎo)致近期或遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙[7]。其對認(rèn)知功能的影響是一個復(fù)雜的過程，涉及多種蛋白質(zhì)的表達(dá)和變化，并引起生物學(xué)信號或通路的改變。而異丙酚可在一定程度上抑制氯胺酮所致caspase-3表達(dá)上調(diào),從而抑制氯胺酮誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡[8-10]，并降低腦氧代謝率及顱內(nèi)壓，同時具有抗脂質(zhì)過氧化作用，可阻斷谷氨酸的傳導(dǎo)路徑，抑制鈣超載，防止由此引起的細(xì)胞損傷[11]，減少自由基的生成[12]等。本研究結(jié)果顯示，氯胺酮組海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)明顯高于生理鹽水組，氯胺酮+異丙酚低劑量組和氯胺酮+異丙酚高劑量組均明顯低于氯胺酮組，但氯胺酮+異丙酚低劑量組仍明顯高于生理鹽水組，氯胺酮+異丙酚高劑量組與生理鹽水組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。氯胺酮組海馬組織蛋白濃度明顯低于生理鹽水組，氯胺酮+異丙酚低劑量組和高劑量組與氯胺酮組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

蛋白組學(xué)分析不僅可以證實(shí)靶點(diǎn)多肽或蛋白質(zhì)存在與否, 而且可以對上調(diào)或下調(diào)的蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析, 對疾病的發(fā)病機(jī)制與治療學(xué)研究具有廣泛的應(yīng)用價值[13]。本研究結(jié)果顯示，氯胺酮+異丙酚組末次給藥后檢測海馬組織蛋白，發(fā)現(xiàn)上調(diào)蛋白6個并鑒定為PD1A3、NDUFB10、HSPA8、ATP5JD、PSMA1、isoform-CRA-c，下調(diào)蛋白9個確定為PPIA、PKM2、GFAP、NSE、SYN1；21d后檢測結(jié)果表達(dá)上調(diào)蛋白為FUBP3、PRDX5，下調(diào)蛋白為GAPDH、AKR1A1、VCP、TUBULINA1B。氯胺酮麻醉后導(dǎo)致突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白(SYN1和DNMr)表達(dá)下調(diào)，而SYNI表達(dá)下調(diào)可以導(dǎo)致囊泡到達(dá)活性區(qū)較少,影響突觸傳遞效率，而21d后VCP表達(dá)下調(diào),不僅影響UPP系統(tǒng)的蛋白降解,還可能抑制NF-κB凋亡活性,這些都會影響海馬的功能恢復(fù)[14]。海馬特異性鈣結(jié)合蛋白(HPCA)主要存在于海馬椎體神經(jīng)元，屬于鈣離子傳感器家族一員，可以調(diào)控海馬神經(jīng)元突觸可塑性的信號通路，影響神經(jīng)細(xì)胞骨架元件的產(chǎn)生、穩(wěn)定等正常生理功能[15]。NDUFB10上調(diào)，NSE、PKM2和AfPSB下調(diào)影響蛋白微管聚合，不利于能量代謝。異丙酚和氯胺酮麻醉藥都存在機(jī)體代償性修復(fù)，異丙酚主要表現(xiàn)在HSPA8、TUBLIN，而氯胺酮通過HSPA8和PSMA1進(jìn)行蛋白質(zhì)量控制。麻醉后21d異丙酚組抗氧化能力增強(qiáng)，大多數(shù)蛋白恢復(fù)正常，主要表現(xiàn)為GAPDH、ATPSB等表達(dá)上調(diào)，而氯胺酮VCP、TUBULINa表達(dá)下調(diào)，不利于蛋白穩(wěn)定，甚至引起神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)只初步篩選了異丙酚及氯胺酮麻醉后海馬組織蛋白的差異表達(dá),但是不能直接反映檢定的差異表達(dá)蛋白在本研究中所發(fā)揮的具體機(jī)制，有待進(jìn)一步探討。

[1] 張子江,劉麗妹. 異丙酚復(fù)合氯胺酮恒速靜脈注射用于小兒表淺手術(shù)麻醉的臨床觀察[J]. 中國醫(yī)藥指南，2013，11(3)：511-512

[2]FredrikssonA，ArcheLT，AimH，etal.NeurofunctionaldeficitsandpotentiatedapoptosisbyneonatalNMDAantagonistadministration[J]．BehavBrainRes，2004，153(2)：367-376

[3]GelbAW，BayonaNA，WilsonJX，etal．Pmpofolanesthesiacomparedtoawakereducesinfarctsizeinrats[J].Anesthesiology，2002，96(5)：1183

[4]ZhaoH,LiQ,ZhangZ,etal.Long-termginsenosideeonsumptionPreventsmemorylossinAgedSAMP8mieebydecreasingoxidativestressandup-regulatingthePlastieity-relatedProteinsinhipocampus[J].BrainRes,2009,1256:111-122

[5]OzturkE，DemirbilekS，KadirButA，etal.Antioxidantpropertiesofpropofolanderythropoietinafterclosedheadinjuryinrats[J].ProgNeuroschopharmacolBiolPsychiatry，2005，29(6)：922-927

[6]RichardJS，DonnaSD.CancerProteomics:fromsignalingnetworkstotumormarkers[J]．TrendBiotechnol，2001,19(10): 40-47

[7]HaskinsWE，KobeissyFH，WolperRA，etal.RapiddiscoveryofputativeproteinbiomarkersoftraumaticbraininjurybySDS-PAGE-capillaryliquidchromatography-tandemmassspectrometry[J].JNeurotrauma，2005，22(6):629-644

[8] 伍佳莉，蘇松，段曉霞，等. 異丙酚對氯胺酮誘發(fā)新生大鼠腦損傷的影響[J]. 中華麻醉學(xué)雜志，2011，31(6)：717-719

[9] 周淑敏，伍佳莉，徐陶，等. 異丙酚對氯胺酮致老齡大鼠認(rèn)知功能障礙的影響[J]. 中華麻醉學(xué)雜志，2010，30(9)：729-730

[10]ChenL，XueZ，JiangH.Effectofpropofolonpathologictime-courseandapoptosisaftercerebralischemia-reperfusioninjury[J].ActaAnaesthesiolScand,2008,52(3):413-419

[11]GrasshoffC，GillessenT.EfectsofpropofolonN-methyl-D-aspartatereceptor-mediatedcalciumincreaseinculturedratcerebrocorticalneurons[J].EurJAnaesthesiol，2005，22(6)：467-470

[12]ChengYJ，WangYP，ChienCT，etal.Small-dosepropofolsedationattenuatestheformationofreactiveoxygenspeciesintourniquet-inducedischemia-reperfusioninjuryunderspinalanesthesia[J].AnesthAnalg，2002，94(6):1617-1620

[13]CidC，Garcia-BonillaL，CamafeitaE，etal.Proteomiccharacterizationofproteinphosphatase1complexesinischemia-reperfusionandischemictolerance[J]．Protepmics，2007，7(17):3207-3218

[14]MaurerMH，HauxD，SakowitzOW，etal.Identificationofearlymarkersforsymptomaticvasospasminhumancerebralmicrodialysateaftersubarachnoidhemorrhage:preliminaryresultsofaproteome-widescreening[J].JCerebBloodFlowMetab，2007，27(10):1675-1683

[15]BairdAE.Bloodgenomicsinhumanstroke[J].Stroke，2007，38(2Suppl):694-698

Research on proteomics improved by propofol in the brain injury of new born rats induced by ketamine anesthesia

FU Wei, ZHOU Chizhong, PAN Derui

(Puren Hospital of Wuhan City, Wuhan 430081, Hubei, China)

Objective It is to investigate the cause of propofol combined with ketamine anesthesia juvenile rat hippocampal neurons and cognitive dysfunction in hippocampal tissue proteomic changes, revealing changes in the pathogenesis of hippocampal neurons, providing guidance for improving clinical anesthesia safety. Methods 80 rats after birth 7d were divided into saline group (N group), ketamine group (K group), propofol+ketamine group (P+K group) low and high dose group children anesthesia simulation and carried hippocampus and hippocampal slices protein extraction, two-dimensional electrophoresis applications and matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF) proteomic differences between studies. Results The water maze reaction spell cognitive function; N hippocampal neuronal apoptosis index, K group, compared with the N group (P<0.01), significant statistical significance, while the P + K group and K group was significantly lower compared to the significantly reduced apoptosis (P<0.05), but the low-dose group P + K is still high compared with the N group, the difference was significant (P<0.05), and P + K high dose groups was not significant. K hippocampal tissue protein concentration, and the NS group, compared with a significant difference. P + K and K group compared with the group with an increasing trend compared with the N -group difference was not significant. K + P group to detect protein in the hippocampus 6h, raised protein found and identified as PD1A3, NDUFB10, HSPA8, ATP5JD, PSMA1, reduced protein PPIA, PKM2, GFAP, NSE, PPIA, PKM2, GFAP and other test results after expressing 21d regulated protein FUBP3, PRDX5, down protein GAPDH, AKR1A1, VCP. Conclusion In this study, a preliminary screening technique in proteomics propofol and ketamine anesthesia differentially expressed in hippocampal tissue protein, in order to improve the prevention and changes in cognitive function in hippocampal neurons provide a theoretical basis for damages.

propofol; brain injury; rats; proteomics

付偉，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科臨床工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.28.007

R-332

A

1008-8849(2015)28-3098-03

2015-06-15