許志萍，吳愛武

(1. 廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180；2. 廣州醫(yī)科大學，廣東 廣州 510180)

mtrR基因突變與淋病奈瑟菌多重耐藥的相關性

許志萍1，吳愛武2

(1. 廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180；2. 廣州醫(yī)科大學，廣東 廣州 510180)

目的了解臨床分離的淋病奈瑟菌對常用抗菌藥物的耐藥性，探討可傳遞多重耐藥(mtr)系統(tǒng)mtrR基因突變與淋病奈瑟菌多重耐藥的相關性。方法采用瓊脂稀釋法檢測30株淋病奈瑟菌臨床株對環(huán)丙沙星、青霉素、四環(huán)素、阿奇霉素、大觀霉素和頭孢曲松6種臨床常用抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC),同時采用紙片碘量法檢測菌株是否產(chǎn)青霉素酶。選取其中僅對1種抗菌藥物耐藥的臨床株和僅對2種抗菌藥物同時耐藥的臨床株以及多重耐藥淋病奈瑟菌株提取DNA，采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增其mtrR基因，并將擴增產(chǎn)物測序，比較其與淋病奈瑟菌標準敏感株的差異。結果30株淋病奈瑟菌中僅對1種抗菌藥物耐藥的有3株(10%)，僅對2種抗菌藥物同時耐藥的有16株(53%)，對3種抗菌藥物同時耐藥的有9株(30%)，對4種藥物同時耐藥的有2株(7%)。30株淋病奈瑟菌的多重耐藥率為37%。有7株菌(23%)檢出青霉素酶陽性。僅對1種抗菌藥物耐藥和僅對2種抗菌藥物同時耐藥的臨床株未發(fā)現(xiàn)mtrR基因突變；11株多重耐藥臨床株均有mtrR基因突變，有7株在第45位發(fā)生Gly(GGC→GAC)Asp突變,有4株在第51位發(fā)生Phe(TTC→GTC)Val突變。結論臨床分離的淋病奈瑟菌多重耐藥率較高，應持續(xù)監(jiān)測淋病奈瑟菌的耐藥性。mtrR基因的第45位Gly(GGC→GAC)Asp突變和第51位Phe(TTC→GTC)Val突變與淋病奈瑟菌的多重耐藥密切相關。

淋病奈瑟菌；mtrR基因；多重耐藥

近年來，由于抗生素的廣泛應用和不合理使用，淋病奈瑟菌的耐藥株日益增加，淋病奈瑟菌的耐藥尤其是多重耐藥已成為淋病防治的一個難點。目前的研究認為，淋病奈瑟菌多重耐藥性的產(chǎn)生與可傳遞多重耐藥(multiple transferable resistant，mtr)系統(tǒng)有關，mtr系統(tǒng)對淋病奈瑟菌的多重耐藥性的調(diào)節(jié)機制在轉(zhuǎn)錄水平上可分為2種：①mtrR依賴調(diào)節(jié)機制，該機制中mtrR基因發(fā)生突變時使其編碼的阻遏蛋白MtrR蛋白合成量減少，對mtrCDE基因的抑制作用減弱，細菌對抗菌藥物主動外排的功能增加，引起細菌對多種抗菌藥物的廣泛耐受。② 非mtrR依賴調(diào)節(jié)機制，在mtrR基因與mtrC基因之間的啟動子區(qū)域有一段長13 bp的插入回文結構，當這一回文結構中3’端的最后一個堿基T/A缺失時，會影響mtrR和mtrC基因的表達,從而提高淋病奈瑟菌對抗菌藥物的耐藥性[1]。并且有研究認為淋病奈瑟菌首先發(fā)生mtrR基因的突變，產(chǎn)生對抗菌藥物的中度抵抗，接著才發(fā)生mtrR基因啟動子區(qū)域13 bp回文序列單個堿基缺失產(chǎn)生的更高抵抗性[2]。為了進一步探討淋病奈瑟菌流行株多重耐藥的產(chǎn)生與mtrR基因突變的關系，為研究淋病奈瑟菌的多重耐藥性及解決其多重耐藥問題奠定基礎，筆者對臨床分離的30株淋病奈瑟菌進行臨床常用抗菌藥物耐藥性檢測，并檢測這些菌株產(chǎn)青霉素酶的情況，同時對多重耐藥菌株進行mtrR基因的檢測及序列分析，現(xiàn)將結果報道如下。

1 研究資料

1.1材料

1.1.1實驗及質(zhì)控菌株 30株淋病奈瑟菌均從2013年1—12月廣州市第一人民醫(yī)院性傳播疾病(STD)門診患者的泌尿生殖道分泌物中分離得到。質(zhì)控菌株為WHO淋病奈瑟菌標準菌株A、B、C、D、E和標準敏感菌株ATCC49226，均購自中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所。

1.1.2主要試劑 GC培養(yǎng)基購自英國OXIOD公司，氧化酶試劑、青霉素酶試劑以及糖發(fā)酵試劑均購自法國梅里埃公司。青霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、頭孢曲松、大觀霉素6種抗菌藥物購于中國藥品生物制品檢定所。PCR試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司，基因擴增引物合成、測序均由大連寶生物工程有限公司完成。

1.2方法

1.2.1細菌培養(yǎng)、鑒定及保存 將接種好臨床標本的GC培養(yǎng)基置于36 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24～48 h。挑取圓形、凸起、濕潤、光滑、半透明或灰白色菌落，經(jīng)革蘭染色，氧化酶、觸酶試驗和糖發(fā)酵試驗確證后，傳代培養(yǎng)18～24 h，收集菌株于脫脂牛奶中，置于-70 ℃低溫冰箱冰凍保存。

1.2.2最低抑菌濃度(MIC)測定 采用WHO西太平洋地區(qū)淋病奈瑟菌耐藥監(jiān)測規(guī)劃推薦的瓊脂稀釋法測定[5]。GC基礎瓊脂高壓滅菌，冷卻到50 ℃后加入10%新鮮羊血。配制6種抗菌藥物原液，再倍比稀釋成各種濃度，加入GC血液基礎培養(yǎng)基后傾注平板。實驗菌株和標準菌株復蘇后傳代2次，用培養(yǎng)18～24 h的菌苔制成107cfu/mL菌懸液，取1～2 μL菌懸液接種于各種抗菌藥物的瓊脂平皿上，置于36 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以WHOA、B、C、D、E標準菌株作質(zhì)控。24 h后觀察結果。在質(zhì)控菌株均在控的情況下，記錄各實驗菌株的MIC。按WHO西太平洋地區(qū)淋病奈瑟菌耐藥監(jiān)測項目推薦的標準判斷結果：環(huán)丙沙星、青霉素和頭孢曲松MIC≤0.03 mg/L為敏感，0.06～0.5 mg/L為中介，≥1 mg/L為耐藥；大觀霉素MIC≤64 mg/L為敏感，≥128 mg/L為耐藥；阿奇霉素MIC≤0.25 mg/L為敏感，0.5 mg/L為中介，≥1 mg/L為耐藥；四環(huán)素MIC≥16.1 mg/L為耐藥。

1.2.3青霉素酶測定 采用紙片碘量法測定菌株產(chǎn)生的青霉素酶，具體操作：取1支試管，加入10 000 IU/mL的青霉素溶液100 μL、1%淀粉溶液100 μL、碘試劑50 μL，混勻呈藍色混合物，在一張濾紙條上滴1滴試劑(50 μL)，將一接種環(huán)培養(yǎng)物涂在藍點上，放置1～2 min，如藍色變成無色即為β-內(nèi)酰胺酶陽性，顏色無變化則為陰性。每次試驗以WHO E株作為陽性對照，A株作為陰性對照。

1.2.4模板DNA制備 將淋病奈瑟菌臨床株與標準敏感株接種至GC平板培養(yǎng)18～24 h，挑取1～2接種環(huán)的菌苔，重懸于100 μL蒸餾水，進行10 min的溫煮后，將其用低溫高速離心機12 000 r/min離心10 min，取上清1 μL作為反應模板。

1.2.5PCR擴增mtrR基因 引物參照Lucas設計的序列[3]，由大連寶生物工程有限公司合成。上游引物為5’-GACGACAGTGCCAAfGCAACG-3’,下游引物為5’-GTCGCAGAIACGTTGGAACAACG-3’。擴增條件為預變性95 ℃ 3 min，1個循環(huán)，95 ℃變性1 min，退火、延伸60 ℃ 30 s，共36個循環(huán)，最后延伸60 ℃ 60 s結束。PCR擴增在美國AB公司出產(chǎn)的熒光PCR擴增儀上完成，其產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外反射透射儀下觀察結果。

1.2.6PCR產(chǎn)物純化與mtrR基因序列測定 對上述擴增產(chǎn)物純化后用雙向測序法測定mtrR基因序列，本步驟由寶生物工程(大連)有限公司協(xié)助完成。

2 結 果

2.1淋病奈瑟菌藥敏結果 30株臨床分離的淋病奈瑟菌中有7株菌(23%)青霉素酶陽性，這些菌株為產(chǎn)青霉素酶淋病奈瑟菌(PPNG)。有10株菌(33%)對四環(huán)素耐藥，這些菌株是TRNG菌株。實驗菌株對環(huán)丙沙星、青霉素、四環(huán)素、阿奇霉素、大觀霉素和頭孢曲松的耐藥率分別為97%,87%,33%,20%,0,0。30株淋病奈瑟菌中僅對1種抗菌藥物耐藥的有3株(10%)，僅對2種抗菌藥物同時耐藥的有16株(53%)，對3種抗菌藥物同時耐藥的有9株(30%)，對4種抗菌藥物同時耐藥的有2株(7%)。30株淋病奈瑟菌的多重耐藥株(對3種及以上藥物耐藥)為11株，多重耐藥率為37%。

2.2淋病奈瑟菌多重耐藥株mtrR基因序列分析 mtrR基因測序結果顯示，與標準敏感株ATCC49226比較，僅對1種抗菌藥物耐藥的3株臨床株與對2種抗菌藥物同時耐藥的3株臨床株未發(fā)現(xiàn)mtrR基因突變；11株多重耐藥臨床株均有mtrR基因突變，其中7株發(fā)生了第45位Gly(GGC→GAC)Asp,4株發(fā)生了第51位Phe(TTC→GTC)Val。其中標準敏感株mtrR基因第45位氨基酸所在的基因序列見圖1，標準敏感株mtrR基因第51位氨基酸所在的基因序列見圖2，多重耐藥株mtrR基因第45位和第51位氨基酸所在的基因序列見圖3和圖4。其中45位氨基酸發(fā)生了G/A的改變，由甘氨酸變成了天門冬氨酸；51位氨基酸發(fā)生了T/G的改變，由苯丙氨酸變成了纈氨酸。

圖1 標準敏感株 mtrR基因第45位氨基酸所在的基因序列

圖2 標準敏感株 mtrR基因第51位氨基酸所在的基因序列

圖3 多重耐藥株mtrR基因序列第45位Gly(GGC→GAC)Asp

圖4 多重耐藥株mtrR基因序列第51位Phe(TTC→GTC)Val

3 討 論

淋病是世界上發(fā)病人數(shù)最多的性傳播疾病之一，隨著抗菌藥物的廣泛應用和不規(guī)范用藥，淋病奈瑟菌的耐藥性越來越嚴重。淋病奈瑟菌對抗菌藥物的耐藥性，尤其是多重耐藥極大地影響了淋病的治療效果和預防控制。多重耐藥即細菌對3種或3種以上抗菌藥物同時耐藥[4]，淋病奈瑟菌一旦變成多重耐藥菌，臨床上可選擇的抗菌藥物更少，進而大大影響淋病的治愈率。本研究結果顯示淋病奈瑟菌多重耐藥率達37%，說明本地區(qū)淋病奈瑟菌的多重耐藥現(xiàn)象占一定的比重，淋病的防治形勢不容樂觀，臨床醫(yī)生在進行淋病的抗感染治療時不能僅依靠經(jīng)驗使用抗菌藥物，一定要根據(jù)實驗室的藥敏結果選擇敏感藥物抗感染治療。

目前的研究認為，淋病奈瑟菌的多重耐藥與mtr系統(tǒng)有關。該基因系統(tǒng)由mtrR和mtrCDE基因組成，他們分別編碼相應的蛋白質(zhì)mtrR蛋白和mtrCDE蛋白。mtrR為調(diào)節(jié)基因，其編碼的mtrR蛋白是阻遏蛋白，可以抑制mtrCDE基因的轉(zhuǎn)錄；而mtrCDE為結構基因，其編碼的mtrC、mtrD、mtrE蛋白細菌細胞膜上，三者形成一個完整的三聯(lián)體結。當mtrR發(fā)生基因缺失或突變時，其編碼的 mtrR阻遏蛋白合成減少，使細胞膜上的mtrCDE基因表達增加，從而增加了細胞對疏水性因子(HAs)和各種抗菌藥物的外排功能，導致多重耐藥的產(chǎn)生[6-8]。

本研究mtrR基因測序結果顯示，僅對1種抗菌藥物耐藥和僅對2種抗菌藥物同時耐藥的淋病奈瑟菌未發(fā)現(xiàn)mtrR基因突變，而多重耐藥淋病奈瑟菌均有mtrR基因突變。提示本地區(qū)淋病奈瑟菌流行株的多重耐藥與mtrR基因突變密切相關，其作用機制可能是mtrR基因突變導致細菌外排系統(tǒng)功能加強，細胞膜通透性降低，從而表現(xiàn)出對環(huán)丙沙星、四環(huán)素、青霉素和阿奇霉素等多種抗菌藥物的耐藥。

齊素文等[9]對淋病奈瑟菌mtrR基因突變的研究結果發(fā)現(xiàn)，29株中對1種抗菌藥物耐藥的淋病奈瑟菌只有1株發(fā)生了mtrR基因突變，對2種以上抗菌藥物耐藥的淋病奈瑟菌株均可以檢測到mtrR基因的第45位和第105位氨基酸的突變。陳宏翔等[10]檢測了10株多重耐藥株均有mtrR基因第14位、第45位和第51位氨基酸的突變；而4株敏感株和2株耐青霉素淋病奈瑟菌未發(fā)現(xiàn)mtrR基因突變。本研究的多重耐藥株只檢測到第45位和第51位氨基酸的突變，并未發(fā)現(xiàn)第14位、第40位和第105位氨基酸的突變，出現(xiàn)這些差異的原因可能與不同地域的菌株其mtrR基因變異各有其特點有關，說明不同地區(qū)在淋病的抗感染治療方面，因為臨床應用的抗菌藥物種類、時間、劑量等各有特點，可能導致不同地區(qū)淋病奈瑟菌多重耐藥基因突變的機制不同，提示在不同地區(qū)分別設立淋病奈瑟菌耐藥監(jiān)測點是非常重要的。

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Correlation between mtrR gene mutation and multi-drug resistant of Neisseria gonorrhoeae

XU Zhiping1, WU Aiwu2

Objective It is to study the drug resistance of Neisseria gonorrhoeae for common antibacterial agents, and to explore the correlation between mtrR system, mtrR gene mutation and multi-drug resistant of Neisseria gonorrhoeae.Methods Agar dilution method was used to detect the minimum bacteriostatic concentration (MIC) of 30 strains of Neisseria gonorrhea clinical strains to 6 kinds of antimicrobial agents commonly used in clinic including ciprofloxacin, penicillin, tetracycline, azithromycin, spectinomycin and ceftriaxone, at the same time penicillin enzyme production was determined by paper iodine volume method. The clinical strains with antimicrobial resistance for one kind of antimicrobial agents, the ones for two kinds and the ones with multi-drug resistance were selected and their DNA was extracted to detect mtrR gene by PCR method, and its differences with Neisseria gonorrhea standard sensitive strains were compared. Results There were 3 clinical strains (10%) with antimicrobial resistance for one kind of antimicrobial agents, 16 ones (53%) for two kinds and 9 ones (30%) for three kinds, 2 ones (7%)for 4 four kinds. The mulit-drug resistance rate was 37%. There were 7 strains whose penicillin enzyme was positive. Gene mutation of mtrR gene was not found in the strains with antimicrobial resistance for one and two kinds of antimicrobial agents, but all the strains with multi-drug resistance had gene mutation, in which 7 strains with Gly(GGC-GAC) Asp mutation on the 45th position, 7 strains with Phe(TTC-GTC)Val mutation on the 51th position. Conclusion Neisseria gonorrhoeae separated in clinic has a high multi-drug resistance rate, and their resistance should be continuously monitored. Gly(GGC-GAC) Asp mutation on the 45th position, Phe(TTC-GTC)Val mutation on the 51th position of mtrR gene are closely related with multi-drug resistance of Neisseria gonorrhoeae.

Neisseria gonorrhoeae; mtrR gene; mulit-drug resistance

許志萍，女，副主任技師，碩士，從事皮膚性病實驗室檢驗工作。

吳愛武，E-mail:aiwwu66@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.28.005

R969.3

A

1008-8849(2015)28-3092-04

2015-01-15

(1. The First People’s Hospital of Guangzhou, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, Guangdong, China; 2. Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, Guangdong, China)