王 鑫，趙艷霞，李海霞，李愛軍

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

Caspase-8、Caspase-9在急性百草枯中毒大鼠腎組織中的表達(dá)及作用研究

王 鑫，趙艷霞，李海霞，李愛軍

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

目的 觀察Caspase-8、Caspase-9在急性百草枯中毒大鼠腎組織中的表達(dá)情況，并探討二者在百草枯中毒腎損傷中所起的作用。方法 將140只SD大鼠(雌雄各半)隨機(jī)分成對(duì)照組70只、染毒組70只，對(duì)照組給予生理鹽水灌胃，染毒組給予50 mg/kg百草枯灌胃染毒。2組分別于灌胃后1，3，7，14，21，28，35d取腎組織標(biāo)本行光鏡下觀察腎組織病理變化，用免疫組化染色法測(cè)定Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)情況，原位末端標(biāo)記法(TUNEL法)標(biāo)記凋亡細(xì)胞。結(jié)果 染毒組大鼠腎組織中Caspase-8從第1天就明顯表達(dá)，第3天達(dá)到高峰，第35天雖有下降，但仍高于對(duì)照組；而Caspase-9的表達(dá)第1天明顯增加，第14天達(dá)到高峰，第35天仍明顯高于對(duì)照組。染毒組第3天凋亡指數(shù)增加，第21天達(dá)到高峰，第35天仍高于對(duì)照組。結(jié)論 Caspase-8、Caspase-9在百草枯中毒大鼠腎組織的表達(dá)發(fā)生改變，細(xì)胞凋亡是百草枯導(dǎo)致腎損傷的機(jī)制之一。

百草枯；中毒；Caspase-8；Caspase-9；腎損傷；細(xì)胞凋亡

百草枯(paraquat,PQ) 是一種有機(jī)雜環(huán)類除草劑，隨著其在農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用，百草枯中毒也日益增多。它對(duì)人畜毒性很高，誤服后病死率在50%～70%[1]。百草枯中毒可導(dǎo)致多臟器損傷，主要是肺臟，其次是腎臟，其以原形從腎臟排出，因此腎功能的損傷程度對(duì)百草枯在體內(nèi)的清除至關(guān)重要。然而，百草枯中毒導(dǎo)致腎損傷的具體機(jī)制還未完全闡明。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cysteine aspartic acid protease,Caspase)是細(xì)胞凋亡的重要傳導(dǎo)通路,Caspase-8、Caspase-9 分別是線粒體途徑和內(nèi)源性途徑的代表性凋亡因子，對(duì)凋亡過程有重要調(diào)控效應(yīng)作用[2]。但二者在百草枯中毒所致腎損傷中的表達(dá)變化在國(guó)內(nèi)外還鮮有報(bào)道。本研究通過觀察、測(cè)定Caspase-8、Caspase-9在百草枯中毒大鼠腎臟中表達(dá)情況，探討它們?cè)诎俨菘葜卸緦?dǎo)致腎損傷中的作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 健康成年清潔級(jí)Sprague Dawley大鼠80只(雌雄各半)，體質(zhì)量250～300 g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(冀)2011-0004。20%百草枯溶液由英國(guó)先正達(dá)公司提供，SABC免疫組化染色試劑盒、兔抗鼠Caspase-8多克隆抗體、兔抗鼠Caspase-9多克隆抗體、原位末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)提供。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 將170只Sprague Dawley大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組70只和染毒組70只。對(duì)照組用1 mL生理鹽水一次性灌胃。染毒組將百草枯50 mg/kg用生理鹽水稀釋至1 mL一次性灌胃建立中毒模型。2組分別于灌胃第1，3，7，14，21，28，35天取10只，麻醉下取腎組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片以備HE染色、免疫組化染色及TUNEL法標(biāo)記。

1.3 免疫組化染色及TUNEL染色 按照SABC試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色，從腎上極取出腎組織，中性甲醛液固定，制成石蠟切片，鏡下觀察每張切片的陽性細(xì)胞。以細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，應(yīng)用免疫組化分析軟件(北京航天航空大學(xué)醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)監(jiān)測(cè)處理)，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不重疊的10×40倍顯微鏡視野，分別計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)陽性染色的平均光密度，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。TUNEL法標(biāo)記：嚴(yán)格參照檢測(cè)試劑盒說明書對(duì)腎組織切片進(jìn)行染色，結(jié)果判定：細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不重疊的10×40倍顯微鏡視野，計(jì)算出平均陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

2 結(jié) 果

2.12組大鼠腎組織病理學(xué)比較 對(duì)照組光鏡下觀察可見腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)清晰，腎間質(zhì)及血管周圍無充血、無炎細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1。染毒組于染毒后腎小球內(nèi)就開始出現(xiàn)紅細(xì)胞增多，腎間質(zhì)不同程度的充血、水腫，可伴有小灶狀、大片狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。染毒后第1天，可觀察到腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性、水腫，管腔輕度狹窄，偶爾出現(xiàn)上皮細(xì)胞脫落壞死；第21天，腎小管上皮細(xì)胞嚴(yán)重水腫，可看到核破裂、溶解、胞漿脫失，上皮細(xì)胞大量壞死、脫落，管腔內(nèi)有不同程度的狹窄，見圖2；第28天以后上皮細(xì)胞水腫減輕，腎小管管腔內(nèi)壞死物逐漸減少。

2.2 大鼠腎組織中Caspase-8表達(dá)情況 對(duì)照組腎組織中Caspase-8輕度表達(dá)，見圖3。染毒組Caspase-8的表達(dá)主要位于腎小管上皮細(xì)胞中，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中可觀察到棕黃色顆粒，第1天表達(dá)就明顯增強(qiáng)(P<0.01),第3天陽性表達(dá)最強(qiáng)(見圖4)，此后開始緩慢下降，第14天、第28天仍明顯強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.01或P<0.05)。見表1。

2.3 大鼠腎組織中Caspase-9表達(dá)情況 對(duì)照組腎組織中Caspase-9輕度表達(dá)，見圖5。染毒組第1天腎組織中Caspase-9即有高表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，其表達(dá)呈持續(xù)高水平第14天達(dá)到高峰(見圖6)，到第35天仍高于對(duì)照組(P<0.01)。見表2。

圖1 對(duì)照組第21天腎組織HE染色表現(xiàn)(400×)

圖2 染毒組第21天腎組織HE染色表現(xiàn)(400×)

圖3 對(duì)照組第3天腎組織中Caspase-8表達(dá)情況(400×)

圖4 染毒組第3天腎組織中Caspase-8表達(dá)情況(400×)

2.4 大鼠腎組織中TUNEL測(cè)定結(jié)果 對(duì)照組、染毒組第21天腎組織中TUNEL標(biāo)記陽性凋亡細(xì)胞情況見圖7及圖8。染毒組第3天時(shí)在腎小管可觀察到標(biāo)記陽性的凋亡細(xì)胞，在第7天時(shí)明顯增加(P<0.01)，第21天時(shí)達(dá)到高峰，第28天時(shí)雖有下降，但仍明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，第35天時(shí)仍高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表1 不同時(shí)點(diǎn)大鼠腎組織中Caspase-8表達(dá)情況

注：①與對(duì)照組比較，P<0.01；②與對(duì)照組比較，P<0.05。

圖5 對(duì)照組第14天腎組織中Caspase-9表達(dá)情況(400×)

圖6 染毒組第14天腎組織中Caspase-9表達(dá)情況(400×)

圖7 對(duì)照組第21天時(shí)腎組織TUNEL標(biāo)記陽性凋亡細(xì)胞情況(400×)

圖8 染毒組第21天時(shí)腎組織TUNEL標(biāo)記陽性凋亡細(xì)胞情況(400×)

表2 不同時(shí)點(diǎn)大鼠腎組織中Caspase-9表達(dá)情況

注：①與對(duì)照組比較，P<0.01。

表3 不同時(shí)點(diǎn)大鼠腎組織中TUNEL標(biāo)記凋亡細(xì)胞情況%)

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與對(duì)照組比較，P<0.01。

3 討 論

百草枯是1，1’-二甲基-4，4’-聯(lián)吡啶二氯化物，分子式為C12H14N2·2Cl。由于它對(duì)周圍環(huán)境無害，而且除草效果好，因此在全世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用[3]。如果使用不當(dāng)、誤服、自殺性服用都可導(dǎo)致中毒，一旦中毒，病程進(jìn)展快且尚無特效解毒藥物，臨床上病死率很高。百草枯導(dǎo)致的肺損傷以及多臟器功能衰竭是死亡的主要原因，但其進(jìn)入機(jī)體后，以分子原形從腎臟排泄，腎功能的健全對(duì)清除體內(nèi)已吸收的百草枯至關(guān)重要，因此腎損傷是影響預(yù)后的重要因素。本實(shí)驗(yàn)觀察到急性百草枯中毒大鼠腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)程度不同的水腫、變性、壞死、脫落，腎小管管腔變窄，腎間質(zhì)充血、水腫，有小灶狀或大片狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)，提示百草枯可引起腎損傷。但其腎損傷的具體機(jī)制還不十分清楚。目前研究認(rèn)為，百草枯引起的腎損傷可能與其聯(lián)吡啶陽離子的氧化、還原反應(yīng)生成的大量氧自由基有關(guān)[4]。大量活性氧(ROS)的產(chǎn)生，不僅引起細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化、線粒體結(jié)構(gòu)和功能的破壞、細(xì)胞內(nèi)的DNA雙鏈損傷，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。丁正同等[5]發(fā)現(xiàn)百草枯中毒小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元有凋亡現(xiàn)象。Takeyama等[6]將肺泡上皮細(xì)胞暴露于低濃度百草枯中也發(fā)生了凋亡現(xiàn)象。

凋亡是一種自然生理過程，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及維持細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量，穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境等方面起著重要作用。在凋亡的效應(yīng)節(jié)段和控制中心，Caspase是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)器，它可以和許多底物起反應(yīng)，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞發(fā)生特有的生化和形態(tài)學(xué)改變，因此它的活化是最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。目前發(fā)現(xiàn)，參與凋亡的Caspase可分為2大類：一類是啟動(dòng)Caspase，成員有Caspase-2，8，9，10等；另一類是效應(yīng)Caspase，包括Caspase-3，6，7等[7]。在哺乳動(dòng)物中，Caspase的激活有2個(gè)主要信號(hào)通路：一是TNFR/NGFR家族成員Fas、TNFR1、DR3、DR4及DR5等參與的死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑,另一個(gè)是以線粒體、細(xì)胞色素C(CytC)為中心的內(nèi)源性凋亡通路。2條通路不是相互獨(dú)立的過程，在信號(hào)啟動(dòng)、傳導(dǎo)、信號(hào)調(diào)節(jié)等方面各不相同，但又有相似之處及交匯點(diǎn)。在外源性途徑中，死亡受體Fas、TNFR1、DR3、DR4及DR5等是位于細(xì)胞膜表面的跨膜蛋白，屬于TNFR/NGFR家族成員，這些膜蛋白在細(xì)胞外具有與其特異性的配體相結(jié)合繼而誘導(dǎo)凋亡的死亡信號(hào)激發(fā)域，在細(xì)胞內(nèi)含有轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)所必需的死亡功能域，當(dāng)細(xì)胞膜表面的死亡受體受到其配體或其他激動(dòng)性抗體激活后，受體分子相互交聯(lián)，其死亡功能域聚集成簇，細(xì)胞內(nèi)接頭蛋白FADD相應(yīng)的死亡功能域與聚體成簇的受體分子的死亡功能域結(jié)合而被募集，聚集在一起的FADD通過N端的DED結(jié)合pro-Caspase8的DED，從而使pro-Caspase8進(jìn)行寡聚化，死亡受體、接頭蛋白FADD、pro-Caspase8以串聯(lián)的形式，組合形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合體(DISC)[8]。DISC中的pro-Caspase8發(fā)生自身裂解成為有催化活性的Caspase-8，從而激活下游的效應(yīng)因子Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7，啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的凋亡程序；同時(shí)活化的Caspase-8還可以使Bcl-2家族中促凋亡相關(guān)蛋白Bid裂開,誘導(dǎo)線粒體外膜通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致線粒體膜電位崩解，引起凋亡相關(guān)因子的釋放，激活Caspase-9，最后激活效應(yīng)器Caspase-3，進(jìn)入內(nèi)源性線粒體凋亡通路，引起細(xì)胞凋亡[9]。在內(nèi)源性凋亡通路中，細(xì)胞內(nèi)外的死亡信號(hào)傳遞到線粒體，細(xì)胞色素C(CytC)釋放出來，和dATP作為復(fù)合因子與胞液中凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)結(jié)合，提供能量誘導(dǎo)Apaf-1自身聚集，形成Apaf-1多聚物，該多聚物募集Caspase-9組成高分子量的復(fù)合物，稱為凋亡小體,凋亡小體中的Caspase-9構(gòu)象發(fā)生改變而活化，進(jìn)而激活下游的Caspase-3[10]。

本研究中觀察到染毒大鼠腎組織中Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，凋亡細(xì)胞率顯著升高。表明由Caspase-8、Caspase-9調(diào)控和介導(dǎo)的凋亡過程在腎組織的損傷中可能發(fā)揮重要作用。但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)， Caspase-8在第3天達(dá)到峰值，Caspase-9在第14天達(dá)到峰值，Caspase-9達(dá)峰值時(shí)間晚于Caspase-8，這可能與Caspase-9既可以通過內(nèi)源性凋亡通路激活，又可以在外源性通路中被有催化活性的Caspase-8激活有關(guān)。通過TUNEL檢測(cè)凋亡細(xì)胞，結(jié)果觀察到凋亡細(xì)胞率的高峰值與Caspase-8、Caspase-9的高表達(dá)在時(shí)間點(diǎn)上不同步。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能有以下幾個(gè)：①細(xì)胞凋亡是十分復(fù)雜的過程，受到多因子及多種因素的調(diào)控。Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)增加并不一定說明凋亡反應(yīng)的增強(qiáng)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Caspase在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，分子的某個(gè)部位可能發(fā)生化學(xué)修飾，使其活性發(fā)生改變[11]。Caspase-8的甲基化程度及陽性表達(dá)與凋亡指數(shù)成正相關(guān)，在凋亡過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，而磷酸化修飾的Caspase-9活性在級(jí)聯(lián)反應(yīng)中受到抑制[12]。②雖然Caspase-8、Caspase-9呈高表達(dá)，但在此時(shí)間點(diǎn)上，凋亡蛋白抑制因子的作用也可能增強(qiáng)[13]。③細(xì)胞凋亡過程是多基因、多步驟的復(fù)雜過程，在不同的時(shí)間點(diǎn)，組織細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的應(yīng)答能力可能存在不同，這需要運(yùn)用基因檢測(cè)，分子生物學(xué)技術(shù)等多種更精確的檢測(cè)方法進(jìn)一步闡明其發(fā)生機(jī)制。

雖然目前百草枯中毒導(dǎo)致腎損傷的具體機(jī)制尚未完全闡明，也無特效治療方法，但大量的ROS及Caspase-8、Caspase-9的高表達(dá)可能是促進(jìn)疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素，因此明確Caspase-8及Caspase-9表達(dá)調(diào)控機(jī)制并予以干預(yù)，可能是治療百草枯中毒的新途徑之一。

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Expressions of Caspase-8,Caspase-9 in the renal tissue of rats with acute paraquat poisoning and the research of cell apoptosis

WANG Xin,ZHAO Yanxia,LI Haixia,LI Aijun

(Handan Central Hospital,Handan 056002,Hebei,China)

Objective It is to investigate the expressions of Caspase-8,Caspase-9 in the renal tissue of acute paraquat-induced poisoning rats,and to explore their function in renal injury induced by paraquat poison.Methods One hundred and forty healthy adult Sprague-Dawley (SD) rats with half males and half females were randomly divided into tow groups： control group with 70 rats which were given normal saline by gavage and poisoned group with 70 rats which were given 50 mg/kg paraquat by gavage.At 1,3,7,14,21,28 and 35 days after poisoning,examples of renal tissue of the rats in both groups were gotten to observe the pathological changes of renal tissue under light microscope,and the expression of Caspase-8,Caspase-9 in kidney were evaluated by immunohistochemistry.TUNEL was used to label apoptotic cells.Results Compared with control group,the expression of Caspase-8 in renal tissue of poisoned group significantly rose at the first day,reached the peak at the 3th day and afterwards decreased slowly,at 35th day,the expression was still higher than that in the control group.The expression of Caspase-9 reached the peak at the 14th day,and kept at relatively high levels up to the 35th day.Apoptosis index of poisoned group significantly rose at the thrid day,reached the peak at the 21th day and at 35th day,the index was still higher than that in the control group.than those in group A.Conclusion The expressions of Caspase-8,Caspase-9 were changed in renal injury of acute paraquat-poisoning rats.The cell apoptosis is one of the mechanism leading to kidney damage.

paraquat; poisoning; Caspase-8; Caspase-9; renal injury; cell apoptosis

王鑫，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)橹卸炯拔Ｖ匕Y救治。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.16.008

R-332

A

1008-8849(2015)16-1734-04

2015-01-11