葛鑫，崔湧，丁炎，劉兵，吳思慧，聶宏光

（中國醫(yī)科大學(xué)1.代謝病分子機制與藥物研究所，沈陽 110122；2.附屬第一醫(yī)院麻醉科，沈陽 110001）

·論著·

1，25-二羥基維生素D3在小鼠肺臟液體清除中的作用

葛鑫1，崔湧2，丁炎1，劉兵1，吳思慧1，聶宏光1

（中國醫(yī)科大學(xué)1.代謝病分子機制與藥物研究所，沈陽 110122；2.附屬第一醫(yī)院麻醉科，沈陽 110001）

目的探討1，25-二羥基維生素D3（1，25-VD3）與在體小鼠肺泡液體清除率（AFC）之間的關(guān)系，以明確其在肺臟液體清除中的作用機制。方法維生素D處理組雄性昆明小鼠用活性維生素D類似物帕立骨化醇腹腔注射2周，應(yīng)用酶標儀測定小牛血清白蛋白濃度的方法測定小鼠在體AFC。用Western blot方法測定小鼠肺組織的上皮鈉通道蛋白表達水平。結(jié)果維生素D處理組小鼠AFC為（31.9±3.8）%，對照組為（19.7±1.9）%（P＜0.05）。阿米洛利敏感性AFC與對照組相比增加了50%。Western blot結(jié)果顯示維生素D處理組小鼠肺組織α-上皮鈉通道蛋白表達水平明顯提高。結(jié)論維生素D能夠增加小鼠AFC，其機制可能與增加上皮鈉通道蛋白表達有關(guān)。臨床上應(yīng)用維生素D治療可能會有利于減輕患者的肺水腫。

維生素D；肺水腫；肺泡液體清除率；上皮鈉通道

目前認為，肺泡液體清除率（alveolar fluid clearance，AFC）對肺臟生理和病理狀態(tài)下的液體平衡，如急性肺損傷和成人呼吸窘迫癥，均起重要的調(diào)控作用。增加AFC能加速肺水腫的恢復(fù)，改善肺泡上皮的氣體交換。相反，減少AFC能降低急性肺損傷和成人呼吸窘迫癥患者的生存率，導(dǎo)致肺水腫的發(fā)生［1］。其中肺泡上皮鈉通道在AFC中扮演關(guān)鍵角色。

1，25-二羥基維生素D3（1，25-VD3）是維生素D的生物活性代謝產(chǎn)物，除了調(diào)節(jié)鈣和磷的代謝外，還具有其他的生物活性。目前認為維生素D參與哮喘、急性肺損傷和慢性阻塞性肺疾病等呼吸疾病的病理過程，能夠降低血管通透性，減輕肺水腫等肺損傷過程［2～4］。因而推測1，25-VD3可能通過改變上皮鈉通道活性，在肺臟液體清除中發(fā)揮保護作用。

本研究擬探討1，25-VD3與在體小鼠AFC之間的關(guān)系，旨在明確其是否通過改變肺泡上皮Na+轉(zhuǎn)運參與其對AFC的調(diào)控作用，從而在肺臟液體清除中發(fā)揮可能的保護作用。

1 材料與方法

1.1 在體小鼠AFC測定

采用健康雄性昆明小鼠，8～10周齡，體質(zhì)量20～30 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（遼）2008-0005。AFC計算方法參照相關(guān)文獻［5］。模型組小鼠腹腔注射200 ng·kg-1·d-1帕立骨化醇（活性維生素D）［6］2周，對照組小鼠腹腔注射等劑量丙二醇（有機溶劑）2周。使用10%水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔麻醉后，鈍性分離氣管。所有小鼠采用完全隨機方法分為4組：經(jīng)氣管插管注入0.3 mL用0.9%生理鹽水配制的等滲5%小牛血清白蛋白于對照組小鼠或模型組小鼠（VD組）；氣管內(nèi)注入0.3 mL含有上述5%小牛血清白蛋白的1 mmol/L阿米洛利于對照組小鼠（阿米洛利處理組，Amil組）或模型組小鼠（VD+Amil組）。通過容量控制的小動物呼吸機（HX-300，成都泰盟科技有限公司）給予麻醉小鼠100%O2通氣30 min，然后用1 mL注射器經(jīng)氣管插管緩慢負壓吸取肺泡內(nèi)液體。用96孔板通過Anthos 2010全自動定量酶標儀（鄭州安圖生物工程有限公司）檢測肺泡液體內(nèi)小牛血清白蛋白的濃度。AFC計算公式如下：AFC（%）=［（Vi-Vf）/Vi］× 100，其中Vf=Vi×Pi/Pf，式中Vi和Vf分別代表起始注入肺泡內(nèi)（i）和灌注30 min后吸出的肺泡液（f）液體體積，P是白蛋白濃度。上述試劑均購于美國Sigma公司。

1.2 Western blot分析

分別提取上述模型組小鼠（腹腔注射200 ng·kg-1·d-1帕立骨化醇—活性維生素D，2周）及對照組（腹腔注射等劑量丙二醇有機溶劑，2周）適量的肺組織，加入蛋白裂解液冰上勻漿，離心收集上清，定量，煮沸15 min，應(yīng)用10%凝膠進行SDS-PAGE分析。在TBST溶解的5%無脂肪凍干奶粉溶液中孵育1 h后，加入一抗，4°C過夜。二抗室溫孵育60 min。每次抗體反應(yīng)后用緩沖液TBST沖洗3次，每次15 min。本實驗所用抗體購自Abcam公司，抗體的稀釋濃度為1∶1 000。應(yīng)用ECL試劑盒（Thermo，SuperSignal），并分析圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

如圖1所示：與對照組相比，VD組小鼠AFC［（31.9±3.8）%］明顯高于對照組［（19.7±1.9）%］，（n=5，P＜0.05）。上皮鈉通道特異性阻斷劑阿米洛利能明顯降低AFC，Amil組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。VD+Amil組AFC也明顯降低，與單獨應(yīng)用維生素D處理的VD組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。VD組阿米洛利敏感性AFC（用總AFC減去應(yīng)用阿米洛利之后的AFC，此部分與上皮鈉通道的活性相關(guān)）與對照組相比增加了50%。表明維生素D能夠增加在體小鼠肺臟液體清除，推測與其增強上皮鈉通道活性相關(guān)。

圖1 維生素D對在體小鼠肺泡液體清除率的影響Fig.1 Influence of vitamin D on alveolar fluid clearance in mice

為了進一步明確上述維生素D增加在體小鼠肺臟液體清除的作用是否與阿米洛利敏感的上皮鈉通道的表達有關(guān)，應(yīng)用Western blot方法比較了上皮鈉通道α亞單位在上述對照組與模型組小鼠肺臟中的表達情況。如圖2所示：VD組小鼠肺組織α-上皮鈉通道蛋白表達水平有所升高（P＜0.05）。

3 討論

維生素D除了參與鈣磷代謝外，與水腫性疾病也有相關(guān)性。Sprinchorn等［7］曾報道了由于維生素D缺乏導(dǎo)致的足和踝關(guān)節(jié)骨髓水腫，應(yīng)用維生素D治療對于這類水腫性疾病有效［8］。肺水腫曾見于維生素D缺乏性低鈣血癥相關(guān)的左心室功能障礙［9］。目前認為AFC在維持肺泡腔干燥方面發(fā)揮著重要作用［10］。有關(guān)維生素D對肺臟AFC的研究數(shù)據(jù)非常有限，研究維生素D與AFC之間的關(guān)系非常必要。

圖2 維生素D對小鼠肺組織上皮鈉通道表達的影響Fig.2 Effects of vitamin D on epithelial sodium channel protein expression in mouse lungs

上皮鈉通道是Na+通過極化上皮細胞頂側(cè)膜的主要通路，肺泡腔內(nèi)Na+由肺泡Ⅱ型上皮細胞頂膜的上皮鈉通道進入細胞，再由位于基底膜側(cè)的Na+-K+-ATP酶主動排出，同時伴隨水的被動吸收［11］。由于Na+的轉(zhuǎn)運是肺泡液體清除的重要驅(qū)動力，肺泡上皮鈉通道在肺臟液體清除中扮演關(guān)鍵角色，推測維生素D可能通過影響位于細胞頂膜側(cè)的阿米洛利敏感性上皮鈉通道改變AFC。帕立骨化醇是一種活性維生素D，本研究中，維生素D處理能夠增加在體小鼠AFC，阿米洛利敏感性AFC與對照組相比增加了50%。證實1，25-VD3能夠增加小鼠AFC，與其增強上皮鈉通道活性有關(guān)。

上皮鈉通道目前已被克隆并研究，至今已克隆出5種上皮鈉通道亞單位，分別命名為α-，β-，γ-，δ-和ε-上皮鈉通道［12］。哺乳動物中有前4種亞單位的表達，其中α-亞單位為其主要的功能亞單位。本研究中，Western blot結(jié)果顯示維生素D處理組（VD組）小鼠肺組織α-上皮鈉通道蛋白表達水平明顯提高，表明1，25-VD3增加小鼠AFC的機制可能與增加上皮鈉通道蛋白表達有關(guān)。本研究結(jié)果對于臨床上應(yīng)用維生素D治療患者肺水腫的可能性提供了理論基礎(chǔ)。

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（編輯 王又冬）

Effectsof1，25-Dihydroxyvitamin D3on Alveolar Fluid Clearance in Mice

GE Xin1，CUIYong2，DINGYan1，LIUBing1，WUSi-hui1，NIE Hong-guang1

（1.Institute of Metabolic Disease Research and Drug Development，China Medical University，Shenyang 110122，China；2.Department of Anesthesiology，The First Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

Objective To explore the relationship between 1，25-dihydroxyvitamin D3（1，25-VD3）and alveolar fluid clearance（AFC）in mice in vivo，and investigate its effects in the process oflung fluid clearance.MethodsKMmale mice were treated with active vitamin D analogue paricalcitol（daily i.p.injection）for 2 weeks，and then the in vivo AFC of these mice was measured by bovine serum albumin protein assays.Western blot was applied to determine epithelialsodium channelprotein levelsin lungs ofthese mice.ResultsIn vivo totalAFC was 31.9%±3.8%in vitamin D-treated mice，and significantly lower in the vehicle-treated controls（19.7%±1.9%，P＜0.05）.Amiloride-sensitive AFC was increased approximately 50%by vitamin D.Western blot showed that the expression of α-epithelial sodium channel was significantly elevated in paricalcitol-treated mouse lungs.ConclusionThese observations suggest that vitamin D augments AFC in mice，which may be related to the augment of epithelial sodium channelprotein expression.The clinicalapplication ofvitamin D therapy may ameliorate pulmonary edema ofpatients.

vitamin D；pulmonary edema；alveolar fluid clearance；epithelial sodium channel

R541.6

A

0258-4646（2015）08-0679-03

國家自然科學(xué)基金（81270098）；遼寧省自然科學(xué)基金（2014021093）

葛鑫（1986-），女，助理實驗師，碩士.

聶宏光，E-mail：niehg@hotmail.com

2015-01-30

網(wǎng)絡(luò)出版時間：