丁喬廖松潔闕嘉麗李晨光余劍

·論 著·

Netrin-1促進氧糖剝奪后腦微血管內(nèi)皮細胞存活☆

丁喬*廖松潔*闕嘉麗*李晨光*余劍*

目的通過建立體外氧糖剝奪模型模擬缺血缺氧環(huán)境，觀察軸突導(dǎo)向因子netrin-1對腦微血管內(nèi)皮細胞氧糖剝奪損傷后的作用。方法體外培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細胞，免疫熒光法檢測其netrin-1受體結(jié)直腸癌缺失基因（deleted in colorectal cancer,DCC）及uncoordinated(UNC)5H2的表達；并使用不同濃度netrin-1作用于氧糖剝奪損傷的腦微血管內(nèi)皮細胞，Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒及Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒檢測其細胞活性。結(jié)果腦微血管內(nèi)皮細胞表達UNC5H2受體，無DCC受體表達；與對照組相比，濃度為10、50、100 ng/mL的netrin-1作用于氧糖剝奪損傷的腦微血管內(nèi)皮細胞后細胞活性增強（10 ng/mL:1.25±0.20,存活率63.33%，P＜0.05;50 ng/mL:1.41±0.17，存活率79.40%，P＜0.05;100 ng/mL:1.33±0.27,存活率75.98%，P＜0.05），且在其濃度為50 ng/mL時細胞活性最強。結(jié)論Netrin-1對氧糖剝奪損傷的腦微血管內(nèi)皮細胞具有劑量相關(guān)的保護作用，這種保護作用可能由其受體UNC5H2介導(dǎo)。

netrin-1氧糖剝奪 血管再生

血管再生是指在已存在的微血管基礎(chǔ)上新生毛細血管通過內(nèi)皮細胞出芽的過程[1-2]，已有研究表明在腦梗死等中樞損害后通過促進血管再生有助于改善神經(jīng)功能[3-4]。Netrin-1是netrins家族中最受關(guān)注的一種軸突導(dǎo)向因子，在胚胎期神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中，它依賴其受體UNC5H及DCC通過化學(xué)性吸引或排斥發(fā)揮引導(dǎo)細胞與軸突遷移的作用[5]。目前越來越多的研究者致力于闡明其在血管再生中的作用[6]，然而，netrin-1對血管再生的作用目前還存在爭議[7]，這可能與局部netrin-1濃度及內(nèi)皮細胞表達的netrin-1受體種類有關(guān)。本實驗擬選用與缺血性卒中密切相關(guān)的腦微血管內(nèi)皮細胞，通過建立體外氧糖剝奪[8]模型模擬缺血缺氧環(huán)境，探討不同濃度的netrin-1對氧糖剝奪損傷后腦微血管內(nèi)皮細胞的作用，并初步探索何種受體參與調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 腦微血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞（rat brain microvessel endothelial cells,RBM?VECs）購自美國cell applications公司，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱（37°C，5%CO2）培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，80%滿瓶時傳代，取對數(shù)生長期細胞分組進行實驗。

1.2 RBMVEC的鑒定及RBMVEC上netrin-1受體UNC5H2、DCC的檢測采用VIII因子相關(guān)抗原（von Willebrand factor protein,VWF）鑒定RBM?VEC并檢測其上UNC5H2、DCC受體的表達。RB?MVEC接種于6孔板，待細胞貼壁后去除培養(yǎng)液，用預(yù)熱至37°C的0.01 MPBS洗3次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗滌后，用0.3%TritonX-100破膜10 min，PBS洗滌后，加入正常山羊血清室溫封閉30 min，PBS洗滌后加入兔抗大鼠VWF（1: 200，Santa Cruz），UNC5H2（1：200，Santa Cruz），

DCC（1:1000，Abcam），同時用0.01MPBS代替一抗作為陰性對照，濕盒中4°C孵育過夜，PBS洗滌3次后加入Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔熒光二抗（1：1000，CST），室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次后用1×hochest 33258避光染核10 min，PBS洗滌2次后于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3 氧糖剝奪模型的建立正常培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細胞去除培養(yǎng)基，加入DMEM無糖培養(yǎng)液，37°C以4 L/min的流速充以95%N2/5%CO2混合氣體30 min以創(chuàng)建一個缺氧環(huán)境，維持1 h，正常組細胞不做任何處理。

1.4 CCK-8試劑盒檢測細胞活性RBMVEC接種于96孔板中，每孔種10000個細胞，設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h細胞貼壁后分別加入含netrin-1 10、50、100 ng/mL的DMEM無糖培養(yǎng)基，陰性對照組僅加DMEM無糖培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h后將細胞置于缺氧環(huán)境，維持1 h，加入CCK-8，37°C孵育2 h，用酶標儀在450 nm波長下比色，計算相對吸光度（A）值，實驗重復(fù)3次。

1.5 Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒檢測細胞活性RBMVEC接種于6孔板，待細胞生長至80%時同上述處理，陰性對照組僅加DMEM無糖培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h后將細胞置于缺氧環(huán)境，維持1 h，用PBS洗滌2次，用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞，收集細胞沉淀，用PBS洗滌細胞沉淀2次，加入1×Annexin V-FITC結(jié)合液300 μL重懸細胞，分別加入Annexin V-FITC及PI各3 μL，室溫下避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析方法采用SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），2組比較采用Dunnett檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光正常培養(yǎng)條件下，VWF陽性表明是腦微血管內(nèi)皮細胞，綠色熒光標記的VWF、UNC5H2蛋白表達于細胞膜，無DCC表達，藍色為細胞核（見圖1、2）。

2.2 CCK-8測細胞活性結(jié)果與僅加培養(yǎng)基的陰性對照組相比，氧糖剝奪（oxygen glucose depriva?tion,OGD）環(huán)境下RBMVEC在培養(yǎng)基中netrin-1濃度為10、50、100 ng/mL時細胞活性增強，吸光度分別為1.25±0.20（P＜0.05）、1.41±0.17（P＜0.05）、1.33±0.27（P＜0.05）,其中netrin-1濃度為50 ng/mL時作用最強（P＜0.05）（如圖3）。

2.3 Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒檢測細胞活性與僅加培養(yǎng)基的陰性對照組相比，OGD環(huán)境下RBMVEC均在培養(yǎng)基中netrin-1濃度為10、50、100 ng/mL時細胞活性增強（存活率分別為63.33%、79.40%、75.98%，P＜0.05），其中netrin-1濃度為50 ng/mL時作用最強（P＜0.05）（圖4）。

圖1 用VWF鑒定RBMVEC A：綠色熒光標記的VWF蛋白(箭頭示)B：細胞核C：融合后。標尺=200 μm

圖2 正常RBMVEC表達UNC5H2情況 A：綠色熒光標記的UNC5H2蛋白(箭頭示)B：細胞核C：融合后。標尺=200 μm

圖3 CCK-8試劑盒檢測細胞活性吸光度值 *與陰性對照組比較，P＜0.05

圖4 Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒檢測細胞活性 (A:陰性對照組；B:Netrin-1 10 ng/mL；C:Netrin-1 50 ng/mL；D:Netrin-1 100 ng/mL）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度netrin-1作用于氧糖剝奪損傷的腦微血管內(nèi)皮細胞后細胞活性增強，濃度為50 ng/mL時細胞活性最強，提示netrin-1對氧糖剝奪損傷的腦微血管內(nèi)皮細胞的劑量相關(guān)的保護作用，這種保護作用可能由其受體UNC5H2介導(dǎo)。

我們在先前的研究中發(fā)現(xiàn)依賴配體netrin-1的條件性促凋亡受體UNC5H2在腦缺血后遠隔丘腦部位呈優(yōu)勢表達[9]，外源性netrin-1蛋白可減輕該部位的細胞凋亡，并改善神經(jīng)功能，提示netrin-1/ UNC5H2參與腦缺血后的神經(jīng)可塑性過程[10]。Ne?trin-1已被證實參與血管再生，但目前的研究結(jié)論并不一致[7]。netrin-1刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及管腔形成，還可促進血管內(nèi)皮細胞與血管平滑肌細胞之間的粘附，增強血管對內(nèi)皮生長因子的反應(yīng)，進而刺激血管再生，因此有研究者提出netrin-1是一種血管生長因子[11-14]。然而，另有研究表明，netrin-1具有抑制血管生成作用，且此過程必須有UNC5H2受體的參與[15-16]。也有研究提出netrin-1的濃度可能與血管再生有關(guān)，低劑量時促進血管再生，高劑量時抑制血管再生[17]。這些研究的不同結(jié)論可能與其實驗條件、netrin-1的劑量及netrin-1受體的表達均有關(guān)系。在本研究條件下，我們發(fā)現(xiàn)netrin-1對氧糖剝奪損傷的腦微血管內(nèi)皮細胞具有劑量相關(guān)的保護作用，且以50 ng/ mL作用最強。

Netrin-1通過何種受體參與血管再生仍不明確，Wilson等[13]在netrin-1刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及管腔形成的過程中并未檢測到受體UNC5H2、DCC、neogenin的大量表達，提示該過程并不依賴于netrin-1的受體；Andrew Nguyen[14]則證實netrin-1通過依賴受體DCC的ERK1/2-eNOS前饋機制增加內(nèi)皮細胞NO量進而誘導(dǎo)血管再生。而Lu、Larrivee等[15-16]卻得出通過受體UNC5H2介導(dǎo)的抑制血管生成作用的結(jié)論。本研究僅檢測到腦微血管內(nèi)皮細胞上有UNC5H2的表達，而無DCC表達，提示UNC5H2可能參與netrin-1對氧糖剝奪后腦微血管內(nèi)皮細胞的保護作用，這還需要進一步驗證。

[1]Semenza GL.Vasculogenesis,angiogenesis,and arteriogenesis: mechanisms of blood vessel formation and remodeling[J].J Cell Biochem,2007,102(4):840-847.

[2]凌莉,張素平,吉章閣,等.外源性基質(zhì)細胞衍生因子-1α對大鼠腦梗死后遠隔部位細胞增殖和血管再生的影響[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2013,39(10):587-591.

[3]Krupinski J,Kaluza J,Kumar P,et al.Role of angiogenesis in patients with cerebral ischemic stroke[J].Stroke,1994,25(9): 1794-1798.

[4]Liman TG,Endres M.New vessels after stroke:postischemic neovascularization and regeneration[J].Cerebrovasc Dis,2012, 33(5):492-499.

[5]Rajasekharan S,Kennedy TE.The netrin protein family[J].Ge?nome Biol,2009,10(9):239.

[6]Ding Q,Liao SJ,Yu J.Axon guidance factor netrin-1 and its re?ceptors regulate angiogenesis after cerebral ischemia[J].Neuro?sci Bull,2014，30:683-691.

[7]Castets M,Mehlen P.Netrin-1 role in angiogenesis:to be or not

to be a pro-angiogenic factor?[J].Cell Cycle,2010,9(8): 1466-1471.

[8]唐兆華,廖正步,支興剛,等.促紅細胞生成素預(yù)處理對氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細胞水腫及AQP4表達的影響[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2012,38(1):31-35.

[9]龔瓊,廖松潔,陳歆然,等.實驗性腦皮層梗死后丘腦ne?trin-1及其受體的表達[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2012,38 (5):298-300.

[10]Liao SJ,Gong Q,Chen XR,et al.Netrin-1 rescues neuron loss by attenuating secondary apoptosis in ipsilateral thalamic nucle?us following focal cerebral infarction in hypertensive rats[J]. Neuroscience,2013,231:225-232.

[11]Park KW,Crouse D,Lee M,et al.The axonal attractant Ne?trin-1 is an angiogenic factor[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(46):16210-16215.

[12]Castets M,Coissieux MM,Delloye BC,et al.Inhibition of endo?thelial cell apoptosis by netrin-1 during angiogenesis[J].Dev Cell,2009,16(4):614-620.

[13]Wilson BD,Ii M,Park KW,et al.Netrins promote developmen?tal and therapeutic angiogenesis[J].Science,2006,313(5787): 640-644.

[14]Nguyen A,Cai H.Netrin-1 induces angiogenesis via a DCC-de?pendent ERK1/2-eNOS feed-forward mechanism[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(17):6530-6535.

[15]Lu X,Le NF,Yuan L,et al.The netrin receptor UNC5B medi?ates guidance events controlling morphogenesis of the vascular system[J].Nature,2004,432(7014):179-186.

[16]Larrivee B,Freitas C,Trombe M,et al.Activation of the UNC5B receptor by Netrin-1 inhibits sprouting angiogenesis[J]. Genes Dev,2007,21(19):2433-2447.

[17]Yang Y,Zou L,Wang Y,et al.Axon guidance cue Netrin-1 has dual function in angiogenesis[J].Cancer Biol Ther,2007,6(5): 743-748.

R743.3

A

2014-09-01）

（責任編輯:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.03.008

☆ 國家自然科學(xué)基金（編號：81371276）；廣東省自然科學(xué)基金自由申請項目（編號：2014A030313065）；中山大學(xué)青年教師培育計劃基金（編號：13ykpy16）

* 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科（廣州 510080）