雷蕾孫寧劉志芬杜巧榮楊春霞張克讓

·論 著·

抑郁癥Notch信號通路相關(guān)因子與去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體的關(guān)系

雷蕾*孫寧*劉志芬*杜巧榮*楊春霞*張克讓*

目的探索去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體（norepinephrine transporter，NET）調(diào)控Notch信號通路的相關(guān)因子在抑郁癥患者及健康人群中的表達(dá)差異。方法對20例抑郁癥患者和20名正常對照外周血提取DNA和RNA，通過實時熒光定量PCR（real-time PCR）檢測Notch信號通路相關(guān)分子Notch1、RBP-jk、Numb、Hes1以及NET基因mRNA表達(dá)，通過PCR和質(zhì)譜法檢測NET基因分型。結(jié)果未在兩組外周血中發(fā)現(xiàn)NET基因表達(dá)；抑郁癥患者外周血Notch信號通路Notch1表達(dá)低于對照組（P=0.001），而抑制Notch通路活性的RBP-jk（P=0.005）、Numb（P=0.002）表達(dá)高于對照組。抑郁癥患者NET基因rs2242446位點三種基因型間RBP-jk（P=0.005）、Numb（P= 0.003）的表達(dá)存在統(tǒng)計學(xué)差異，TC型患者的RBP-jk（P=0.008）、Numb（P=0.006）表達(dá)高于TT型；基因型間合并后發(fā)現(xiàn)，攜帶有rs2242446位點C等位基因患者（CC+TC型）RBP-jk（P=0.001）、Numb（P=0.001）的表達(dá)高于TT型。rs28386840位點T等位基因患者（AT+TT型）的Hes1表達(dá)低于AA型（P=0.028）。結(jié)論初步探索發(fā)現(xiàn)抑郁癥可能存在外周血Notch信號通路相關(guān)因子表達(dá)調(diào)控異常，推測NET基因可能調(diào)控Notch信號通路進(jìn)而影響抑郁癥的發(fā)生。

抑郁癥Notch信號通路去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體神經(jīng)可塑性

目前認(rèn)為抑郁癥患者存在神經(jīng)可塑性障礙，抗抑郁藥通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性而發(fā)揮作用，而Notch信號通路是調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)可塑性的一條重要途徑[1]。去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體（norepinephrine transporter，NET）可改變突觸間隙去甲腎上腺素（norepinephrine,NE）濃度，NET能抗抑郁藥物可促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖、再生，降低海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotroph?ic factor，BDNF）表達(dá)水平，進(jìn)而影響大腦神經(jīng)可塑性[2-3]。Hu等[4]研究發(fā)現(xiàn)NET基因缺陷小鼠Numb（Notch通路的抑制調(diào)節(jié)因子）表達(dá)升高，Notch信號通路活性減弱。以上研究提示NET基因缺陷可能影響Notch信號通路。本研究擬通過檢測抑郁癥患者與正常對照外周血NET基因分型以及NET、Notch信號通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平，初步探索抑郁癥外周血Notch信號通路表達(dá)水平以及NET基因?qū)otch信號通路的調(diào)控作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2014年4～6月于山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院精神衛(wèi)生科門診就診的抑郁癥患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①18～50歲，漢族；②首次發(fā)病，未經(jīng)任何治療；③符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition，DSM-Ⅳ）中重性抑郁障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)，使用標(biāo)準(zhǔn)化的DSM-IV-TR軸I障礙定式臨床檢查（structured clinical interview for DSM-IV-TR axis I disorders，SCID-I）作篩查工具；④漢密爾頓抑郁量表17項版本（Hamilton depres?sion scale，HAMD-17）評分≥17分；⑤相互間無血

緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有重大軀體疾病或有顱腦外傷史；②患有其它神經(jīng)精神系統(tǒng)疾?。虎圩罱?個月內(nèi)接受過抗抑郁、抗精神病藥物治療或電休克治療；④妊娠或哺乳期女性。

選擇同期來源于社區(qū)的健康志愿者作為正常對照。納入標(biāo)準(zhǔn)：①18～50歲，漢族；②無神經(jīng)精神疾病；③兩系三代無精神疾病家族史；④相互間及與患者間無血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有重大軀體疾病或有顱腦外傷史；②妊娠或哺乳期女性。

共收集抑郁癥患者20例，其中男性9例，女性11例，平均年齡（27.77±8.31）歲。收集對照20名，男性10名，女性10名，平均年齡（29.13±6.56）歲。抑郁組與對照組間性別（χ2=0.100，P=0.752）、年齡（t=0.574，P=0.569）無統(tǒng)計學(xué)差異。所有被試對本研究同意并簽署知情同意書。本研究方案經(jīng)過山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.2 DNA提取與基因型檢測

1.2.1 DNA提取 研究對象于抽血當(dāng)天晨起空腹，常規(guī)消毒，抽取靜脈血4 mL。其中2 mL置于-20℃低溫冰箱保存，隨后使用FlexGen Blood DNA Kit試劑盒提取DNA，4℃低溫保存。

1.2.2 篩選SNP參考Hapmap數(shù)據(jù)庫的中國漢族人群（Chinese Han in Beijing,China，CHB）數(shù)據(jù)，結(jié)合既往研究，選擇可能與抑郁癥病理機制相關(guān)的NET基因3個功能區(qū)SNP：rs2242446（T-182C）、rs5569（G1287A）和rs28386840（A-3081T）[5-6]。

1.2.3 基因分型 使用MassARRAY?MALDI-TOF MS質(zhì)譜檢測平臺[7-8]對樣本DNA檢測NET基因3個SNP位點（基因科技上海有限公司），使用TYP?ER 4.0軟件（Sequenom公司，USA）分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)以進(jìn)行SNP等位基因分型。SNP引物見表1。

1.3 mRNA提取及檢測

1.3.1 淋巴細(xì)胞液提取 取新鮮全血2 mL，加1 mL 3%檸檬酸鈉，混勻后3000 r/min離心10 min（4℃），取淺黃色中層，即為淋巴細(xì)胞液。

1.3.2 RNA提取 取淋巴細(xì)胞液150 μL加入離心管（經(jīng)DEPC水處理），加入1 mL TRIZOL試劑，振蕩混勻，冰浴中放置5 min。按TRIZOL提取方法操作：加入350 μL氯仿，充分振蕩混勻，靜置分層后，立即于12000 r/min離心20 min（4℃）；將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管，加等體積的異丙醇（4℃預(yù)冷）混勻；-20℃放置1 h，12000 r/min離心20 min（4℃），沉淀即獲得總RNA；加入0.5 mL 75%乙醇洗滌，12000 r/min離心10 min（4℃），小心倒掉乙醇，室溫放置10 min，加30 μL適量DEPC處理水溶解沉淀，-80℃低溫保存。

取5 μL RNA，經(jīng)紫外分光光度計測定A260和A280值，并經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性。選擇A260/A280比值在1.8～2.1的RNA樣品，進(jìn)行后續(xù)的實時熒光定量PCR（real-time PCR）。

1.4 Real-time PCR檢測mRNA表達(dá)使用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.00分別設(shè)計NET、Notch1、RBP-jk、Numb、Hes1的mRNA引物，使用Oligo 6.69軟件驗證，并在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的基因庫中比對后得出可行性序列。所有引物序列均由上海生物工程公司合成，見表2。

表1 SNP引物

先使用DNase I消化樣品RNA中的DNA；后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；將cDNA稀釋10倍后，使用7900HT Real-time PCR儀（Applied Biosystems，USA）進(jìn)行PCR反應(yīng)（每個樣品作3管）。反應(yīng)體系：SYBR Mix 10 μL，上下游引物（見表1）各0.4 μL，cDNA 1 μL加DEPC水補足體積至20 μL。反應(yīng)條件：50°C 2 min，95°C 2min；然后95°C變性15 s，60°C退火60 s，共40個循環(huán)。所有SYBR Master Mix購于TOYOBO，引物由Invitrogen合成。檢測

Ct值后，使用GAPDH作為內(nèi)參，經(jīng)2-ΔΔCt轉(zhuǎn)換后得到各mRNA相對含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。抑郁組和對照組外周血Notch信號通路相關(guān)因子（Notch1、RBP-jk、Numb、Hes1）mRNA表達(dá)水平呈非正態(tài)分布，采用中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）[M（QL，QU）]描述，組間比較采用Mann-Whit?ney U檢驗。抑郁組分別按NET基因各SNP位點的基因型分亞組，采用Kruskal-Wallis檢驗比較三個亞組之間mRNA的表達(dá)水平，進(jìn)一步兩兩多重比較采用Nemenyi法?？紤]到部分純合子基因型較為罕見，將樣本量少的純合子與雜合子基因型合并，比較mRNA表達(dá)水平。檢驗水準(zhǔn)α為0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 抑郁組與對照組NET基因及Notch信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平在20例抑郁癥患者和20例對照外周血中，未檢測到NET基因的表達(dá)。抑郁組和對照組外周血中Notch信號通路Notch1、RBP-jk、Numb、Hes1的mRNA表達(dá)情況見表3。抑郁組Notch1表達(dá)低于對照組（Z=-3.256，P=0.001），RBP-jk（Z=-2.800，P=0.005）、Numb（Z=-3.132，P= 0.002）表達(dá)高于對照組，未發(fā)現(xiàn)抑郁組與對照組間Hesl的mRNA表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 NET基因不同分型抑郁癥患者Notch信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平NET基因rs2242446位點不同基因型抑郁癥患者RBP-jk（χ2=10.640，P=0.005）、Numb（χ2=11.375，P=0.003）mRNA的表達(dá)水平具有統(tǒng)計學(xué)差異，進(jìn)一步經(jīng)Nemenyi秩和檢驗發(fā)現(xiàn)，TC基因型患者的RBP-jk（P=0.008）、Numb（P=0.006）mRNA表達(dá)高于TT型患者；未發(fā)現(xiàn)NET基因型間其他各mRNA表達(dá)水平存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表4。

基因型合并后，攜帶rs2242446位點C等位基因（TC+CC型）的抑郁癥患者RBP-jk（Z=-3.240，P=0.001）、Numb（Z=-3.240，P=0.001）mRNA的表達(dá)水平高于TT型患者。攜帶rs28386840位點T等位基因（AT+TT型）的抑郁癥患者Hes1（Z=-2.199，P=0.028）表達(dá)低于AA型患者。未發(fā)現(xiàn)rs5569各基因型間Notch通路相關(guān)基因表達(dá)存在差異（P＞0.05），見表4。

3 討論

表2 Real-time PCR引物

表3 抑郁組和對照組外周血中Notch信號通路基因mRNA表達(dá)水平[M（QL，QU）]

隨著近些年抑郁癥神經(jīng)可塑性假說的不斷發(fā)展，學(xué)者們開始思考并關(guān)注神經(jīng)元再生領(lǐng)域的相關(guān)研究。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者存在海馬體積縮小，伴神經(jīng)細(xì)胞萎縮和缺失[9-10]，抗抑郁藥治療可阻止抑郁癥患者海馬體積減小，并部分逆轉(zhuǎn)實驗動物因應(yīng)激誘導(dǎo)而產(chǎn)生的海馬萎縮[11]。

Notch信號通路調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、神經(jīng)細(xì)胞軸突和樹突的生長，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生有重要作用，是調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)可塑性的一條重要途徑。Notch信號通路由Notch受體、配體及下游的效應(yīng)物三部分組成。哺乳動物中有4個同源

Notch受體（Notch1～4）和5個同源配體（Dll1、Dll3、Dll4、Jag1和Jag2）。轉(zhuǎn)錄抑制因子RBP-jk可與Notch的活化形式NICD結(jié)合形成NICD-CSL復(fù)合體后進(jìn)而激活靶基因的表達(dá)。Numb被認(rèn)為是細(xì)胞不對稱分裂的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)點，含Numb的細(xì)胞Notch活性受抑制，不含則Notch通路活化。Notch的下游主要靶基因為E(spl)/Hes或ESR基因家族，如Hesl、Hes5等，Notch系統(tǒng)可直接促進(jìn)這類分子的表達(dá)，最終影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。研究顯示，Notch信號通路在成年動物海馬區(qū)持續(xù)表達(dá)，且發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)重塑的作用。

表4 NET基因不同分型患者Notch信號通路基因mRNA表達(dá)水平[M（QL，QU）]

本研究首次在抑郁癥患者外周血白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Notch信號通路中Notch1基因的mRNA表達(dá)低于正常對照，而抑制Notch通路活性的RBP-jk、Numb的mRNA表達(dá)高于正常對照。關(guān)于Notch通路與抑郁癥的相關(guān)性之前在動物實驗中已有報道：Costa等[12]發(fā)現(xiàn)Notch基因缺陷型小鼠表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙；郭怡菁等[13]在缺血卒中大鼠模型中發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激后大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡及Notch通路活性下降；隋毓秀等[14-15]研究也發(fā)現(xiàn)抑郁模型大鼠海馬Notch信號通路的功能呈下調(diào)趨勢，與齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖抑制同步，給予抗抑郁藥氟西汀干預(yù)后，大鼠海馬齒狀回NSCs增殖顯著增加，同時Notch信號通路相關(guān)mRNA表達(dá)及蛋白水平顯著升高。以上研究均提示Notch信號通路調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性與抑郁癥的發(fā)生有關(guān)。

NET再攝取抑制劑是臨床常見的抗抑郁藥，可促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖、再生，進(jìn)而影響大腦神經(jīng)可塑性。Hu等[4]研究發(fā)現(xiàn)NET基因缺陷小鼠Numb表達(dá)增高，Notch信號通路活性減弱。據(jù)此推測，NET可能通過影響Notch信號通路，調(diào)控大腦神經(jīng)可塑性變化，進(jìn)而參與抑郁癥的發(fā)生。目前所報道的檢測NET基因表達(dá)研究，實驗材料大多來自于組織細(xì)胞，如胎盤、腫瘤、動物大腦等[16-17]。然而本研究在外周血白細(xì)胞中未能檢測出NET基因的表達(dá)，可能原因與大部分NET都是在神經(jīng)或其它組織細(xì)胞膜表面重吸收有關(guān)，所以在外周NET表達(dá)少，提示NET基因可能主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)[18]。

因此，為了進(jìn)一步明確NET基因與Notch信號通路的關(guān)聯(lián)性，我們對NET基因進(jìn)行基因分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶有NET基因rs2242446位點TC基因型患者的RBP-jk、Numb表達(dá)高于TT型患者，未發(fā)現(xiàn)其他NET基因型間Notch表達(dá)存在差異。由于部分純合子樣本例數(shù)偏少，為進(jìn)一步探索等位基因間Notch表達(dá)差異，將rs2242446位點含C等位

基因的TC、CC基因型患者合并，rs28386840位點含T等位基因的AT、TT基因型患者合并，rs5569位點含A等位基因的GA、AA基因型合并。發(fā)現(xiàn)攜帶有rs2242446位點C等位基因（TC+CC型）的抑郁癥患者RBP-jk、Numb的表達(dá)高于TT組患者，攜帶rs28386840位點T等位基因（AT+TT型）的抑郁癥患者Hes1表達(dá)低于AA組患者。rs2242446和rs28386840基因多態(tài)性均位于NET基因啟動子區(qū)，其基因突變可能會影響NET基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性[19]，導(dǎo)致NET基因表達(dá)改變。既往研究表明，去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白可能通過改變細(xì)胞內(nèi)的水平，進(jìn)而影響功能變化[20]。因此，以上結(jié)果提示NET基因變異可能引起RBP-jk、Numb的增加，最終抑制Notch信號通路活性，NET基因在Notch信號通路的表達(dá)中起一定調(diào)控作用。

綜上，本研究初步探討在患者外周血中Notch信號通路相關(guān)因子與抑郁癥的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NET的不同基因型間可能存在Notch信號通路表達(dá)差異，推測NET可能調(diào)控Notch進(jìn)而影響抑郁癥的發(fā)生。但本研究存在一定的局限性：首先研究樣本量偏小，且可能存在地區(qū)差異等，未來還需進(jìn)一步擴大樣本量來驗證；其次，本研究僅檢測Notch相關(guān)mRNA的表達(dá)水平，尚未檢測相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平，也有待進(jìn)一步補充實驗完善結(jié)論；此外，NET基因與Notch信號通路以及抑郁癥的關(guān)聯(lián)性還需進(jìn)一步在功能學(xué)上進(jìn)行驗證。未來的研究需要通過建立抑郁動物模型，比較不同組間Notch信號通路相關(guān)因子的mRNA/蛋白表達(dá)水平以及相關(guān)腦區(qū)結(jié)構(gòu)和功能上的差異，來進(jìn)一步明確NET基因調(diào)控Notch信號通路介導(dǎo)的神經(jīng)可塑性與抑郁發(fā)生的關(guān)聯(lián)性。

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R749.4

A

2014-10-27）

（責(zé)任編輯:肖雅妮）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.03.010

☆ 國家自然科學(xué)基金面上項目（編號：81171290，81471379）；山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項目（編號：2013119）

* 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院精神衛(wèi)生科（太原 030001）