姜紅劉廣志周建華楊亭亭向雅娟敖冬慧高旭光

·短著述·

多發(fā)性硬化抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫活性☆

姜紅*劉廣志*周建華△楊亭亭*向雅娟*敖冬慧*高旭光*

多發(fā)性硬化CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞白介素轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis,MS）是一種發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性脫髓鞘疾病，致殘率很高，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[1]。其發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全明確，多認(rèn)為由于基因和環(huán)境的相互作用有關(guān)[2]。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)MS患者外周血CD4+CD25highTreg的效應(yīng)功能較正常對(duì)照下降[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)靜脈注射給予EAE鼠CD4+CD25+Treg可明顯緩解其臨床病情[4]。獲取足量功能改善的Treg并自體回輸無(wú)疑會(huì)為MS治療提供一個(gè)安全有效新途徑。

既往我們通過(guò)體外誘導(dǎo)的方法，以髓鞘堿性蛋白（MBP）85-99肽段作為抗原，以同種異體CD40配體激活的B細(xì)胞為APC，和患者的CD4+CD25-細(xì)胞共培養(yǎng)，并以髓鞘堿性蛋白（MBP）85-99、可溶性4-1BBL、雷帕霉素共刺激10 d，在體外誘導(dǎo)出功能正常的Treg[5]，但其機(jī)制尚未明確。因此本文檢測(cè)了體外誘導(dǎo)的Treg和CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液中IL-10(白細(xì)胞介素-10)和TGF-β1（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1）的表達(dá)，以期對(duì)Treg的功能抑制機(jī)制作進(jìn)一步的探討。

1 對(duì)象與方法

1.1 病例收集設(shè)MS組（n=5）和健康對(duì)照組（n=5），全部為北方漢族人，均經(jīng)SSP-PCR方法進(jìn)行HLA-DRBl基因分型后證實(shí)為DR2+。MS入組標(biāo)準(zhǔn):①患者知情同意；②所有MS患者符合2005年McDonald年診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，且均為病情穩(wěn)定的復(fù)發(fā)-緩解型MS。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前6個(gè)月內(nèi)曾接受免疫調(diào)節(jié)藥物治療；②合并有其他自身免疫性疾病。健康對(duì)照經(jīng)檢查均排除神經(jīng)系統(tǒng)疾病和其他自身免疫病。B細(xì)胞由同種異體的健康志愿者外周血分離。

1.2 B細(xì)胞的磁珠分選、體外培養(yǎng)人CD4+初始T細(xì)胞的磁珠分選及鑒定使用B細(xì)胞的磁珠分離試劑盒和CD4+初始T細(xì)胞的磁珠分離試劑盒進(jìn)行，具體操作步驟見(jiàn)[5]。

1.3 人MBP85-99特異性Treg的誘導(dǎo)、擴(kuò)增及分選將MS患者及健康對(duì)照CD4+初始T細(xì)胞與同種異體B細(xì)胞混合，加入MBP85-99肽段（0.2μg/mL）、可溶性4-1BBL（0.2μg/mL）、雷帕霉素（109 nmol/L）培養(yǎng)10 d，加入抗人CD4（Percp）、CD25(APC)、CD127(FITC)單抗送北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部流式細(xì)胞進(jìn)行分選Treg細(xì)胞。具體操作步驟見(jiàn)[5]。

1.4 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)使用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離MS患者及對(duì)照新鮮外周血中單個(gè)核細(xì)胞，每108個(gè)細(xì)胞加入20μL抗人CD4 PerCP、CD25APC McAb各20μL，送北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行流式分選CD4+CD25-T細(xì)胞。將分選所獲Treg（2x104個(gè)/孔）與自體CFSE標(biāo)記的CD4+CD25-T細(xì)胞按1:1比例共培養(yǎng)，同時(shí)加入經(jīng)鈷60（30Gray）照射的自體PBMC 1x105個(gè)/孔,加入含有10%FBS的RP?MI 1640培養(yǎng)液150μL進(jìn)行培養(yǎng)。病例組和對(duì)照組均分為3個(gè)亞組：①陰性對(duì)照：CD4+CD25-T細(xì)胞+PBMC+Treg；②MBP組：CD4+CD25-T細(xì)胞+PBMC+Treg+MBP85-99肽段；③陽(yáng)性對(duì)照：CD4+CD25-T細(xì)胞+PBMC+Treg+抗-CD3和抗-CD28 McAb,3 d后收集細(xì)胞，取上清液用以檢測(cè)上清液中IL-10和TGF-β1的表達(dá)。由于病例組和對(duì)照組各有1例在培養(yǎng)中出現(xiàn)污染，最終病例組及對(duì)照組均只得到4例的檢測(cè)結(jié)果。

1.5 ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清IL-10和TGF-β1的表達(dá)使用ELISA試劑盒檢測(cè)檢測(cè)培養(yǎng)上清里IL-10和TGF-β1的表達(dá)，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行。所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣本均復(fù)空加樣，取均值進(jìn)行分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品均值數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣本濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)分析分別采用單因素方差分析和T檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)上清中IL-10的含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品均數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=38.01x-1.872。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度，MS組中各亞組IL-10的平均濃度分別為：陰性對(duì)照組（1.58±0.09）pg/mL，MBP組為（2.32±0.12）pg/mL，陽(yáng)性對(duì)照組為（1.63±0.08）pg/mL。健康對(duì)照組中各亞組IL-10的平均濃度分別為：陰性對(duì)照組

(1.62±0.12)pg/mL，MBP組為（2.26±0.08）pg/mL，陽(yáng)性對(duì)照組為（1.62±0.11）pg/mL。MS組和健康對(duì)照組中各亞組比較：陰性對(duì)照組和MBP組比較、陽(yáng)性對(duì)照組和MBP組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 培養(yǎng)上清中TGF-β1的含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品均數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=755.1x+ 89.89。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度，MS組中各亞組TGF-β1的平均濃度分別為：陰性對(duì)照組(168±23)pg/mL，MBP組為（267±49）pg/mL，陽(yáng)性對(duì)照組為（181±25）pg/mL。健康對(duì)照組中各亞組TGF-β1的平均濃度分別為：陰性對(duì)照組（160±37）pg/mL，MBP組為（249±30）pg/mL，陽(yáng)性對(duì)照組為（171±30）pg/mL。MS組和健康對(duì)照組中各亞組比較：陰性對(duì)照組和MBP組比較、陽(yáng)性對(duì)照組和MBP組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

我們的研究發(fā)現(xiàn)，以髓鞘堿性蛋白（MBP）85-99肽段作為抗原，以同種異體CD40配體激活的B細(xì)胞為APC，與初始T細(xì)胞共培養(yǎng)，并以MBP85-99、可溶性4-1BBL、雷帕霉素共刺激10 d所誘導(dǎo)的Treg在與CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)均可分泌IL-10和TGF-β1，且病例組和對(duì)照組之間無(wú)顯著差異，結(jié)合我們既往的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[5]，進(jìn)一步說(shuō)明病例組和對(duì)照組所誘導(dǎo)的Treg具有類似的免疫抑制功能，并且通過(guò)分泌IL-10和TGF-β1實(shí)現(xiàn)。

圖1 IL-10標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 TGF-β1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

TGF-β和IL-10是CD4+CD25+Treg所分泌的主要細(xì)胞因子。TGF-β有6種亞型，其中TGF-β1占90%以上。本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是病例組還是對(duì)照組，各亞組中MBP組TGF-β 1和IL-10的濃度均明顯高于其他亞組，說(shuō)明該誘導(dǎo)的Treg確為抗原特異性Treg。盡管如此，在以往所作的增殖分析中，MBP亞組的增殖抑制能力僅較其他亞組略強(qiáng)[5]，究其原因可能與Treg的其他作用機(jī)制有關(guān)。現(xiàn)多認(rèn)為在抗原濃度低時(shí)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞接觸發(fā)揮作用，而在抗原濃度高時(shí)該細(xì)胞同時(shí)通過(guò)分泌IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。Treg亦可表達(dá)CTLA，CTLA和效應(yīng)T細(xì)胞表面的B7結(jié)合傳遞抑制信號(hào)，抑制T細(xì)胞的活化與增殖[7]。對(duì)此今后應(yīng)對(duì)誘導(dǎo)后Treg上CTLA表達(dá)的檢測(cè)以明確此點(diǎn)。

Jun等[8]發(fā)現(xiàn)，給予實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠尾靜脈注入Treg可減輕病情嚴(yán)重程度，而使用TGF-β抗體中和TGF-β后，Treg的保護(hù)作用則喪失。Ma等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在獼猴EAE中，總CD4+CD25+Treg和分泌IL-10的I型Treg的數(shù)量和抑制功能在急性期顯著下降，IL-10水平在急性期急劇下降達(dá)9倍之多。醋酸格拉默（GA）是復(fù)發(fā)RRMS治療中的一線用藥，其作用機(jī)制還不清楚。將GA和Treg體外共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，GA可明顯增加Treg分泌IL-10的水平[10]。以上研究表明，TGF-β和IL-10對(duì)MS具有重要的緩解作用，由于我們所誘導(dǎo)的Treg也可分泌一定水平的TGF-β和IL-10，故給MS患者輸入該細(xì)胞即相當(dāng)于增加了外源性TGF-β和IL-10，可能對(duì)MS具有一定的治療作用。

目前，Treg已報(bào)道用于I型糖尿病[11]和移植物抗宿主病[12]的治療。上述治療中，Treg均顯示出良好的療效和安全性，但是機(jī)制還不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性硬化病人體外誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞未存在功能缺陷，且可以通過(guò)分泌IL-10和TGF-β1來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制功能。但是，IL-10和TGF-β1只是Treg發(fā)揮抑制功能的一條途徑，對(duì)Treg發(fā)揮抑制功能的其他機(jī)制如接觸抑制、CD39和CD73的表達(dá)等方面還需要進(jìn)一步研究，才能更好地將體外誘導(dǎo)的抗原特異性Treg用于臨床治療。討論內(nèi)容沒(méi)有著重突出本研究的新意。

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R744.51(

2014-07-09）

A（責(zé)任編輯:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.03.012

☆ 國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào):81171123）

* 北京大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（北京 100044）

△北京大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室