吳斌 吳鏗

2型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，臨床表現(xiàn)包括口渴、多飲、多食、多尿、消瘦等，主要是由于胰島素分泌和/或作用缺陷所引起。T2DM的發(fā)展是多因素、多基因參與的過程，其致病機制復(fù)雜，包括遺傳因素和環(huán)境因素，現(xiàn)有的診斷標(biāo)準(zhǔn)并不能從遺傳學(xué)的角度解釋病因及發(fā)病機制，難以從基因的整體表達譜全面地觀察2型糖尿病發(fā)病時基因的反應(yīng)模式，并且具有一定的滯后性，因而研究起來費時、費力、進度緩慢。然而，越來越多的研究表明，遺傳因素在T2DM的發(fā)病過程中占據(jù)更為主要的地位，全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS）證實，T2DM有眾多的遺傳易感基因[1-2]。因此，基因診斷就顯得尤為重要，從基因角度分析2型糖尿病，對2型糖尿病的診治將會提供更多的幫助。本文就基因診斷在2型糖尿病中的研究進展作一綜述。

1 基因診斷的研究現(xiàn)狀

1.1 基因診斷概述 基因診斷是一項在重組DNA技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的應(yīng)用技術(shù)，其檢測原理是對受檢者的某一特定基因（DNA）和/或其轉(zhuǎn)錄物（RNA）進行分析和檢測，進而對相應(yīng)的疾病做出診斷，從基因水平闡明疾病的病因所在。目前，基因診斷技術(shù)已經(jīng)廣泛的被應(yīng)用于諸多領(lǐng)域[3]?；诓煌臋z測內(nèi)容，基因診斷可以分為DNA診斷和RNA診斷兩部分。前者主要分析基因的結(jié)構(gòu)如DNA序列的缺失、插入、點突變等；后者側(cè)重分析基因的功能，如mRNA量的變化、外顯子變異以及間接加工缺陷等。按照檢測策略，基因診斷也可以分為兩大類：一類為直接基因診斷，指直接對致病基因本身進行檢查。通常應(yīng)用基因本身或鄰近的DNA序列作為探針，也可以利用PCR擴增產(chǎn)物進行基因探查，以檢測有無點突變、缺失等異常并且判斷其性質(zhì)；另一類為間接基因診斷，主要用于當(dāng)基因結(jié)構(gòu)不清、復(fù)雜或突變過多而導(dǎo)致無法一一檢測時，對被檢者及其家系進行遺傳連鎖分析，通過鑒定遺傳標(biāo)記的存在，進而確定患者是否獲得帶有致病基因的染色體[4]。

1.2 基因診斷的研究技術(shù)及相關(guān)技術(shù) （1）Southern blot和Nouthern blot：檢測特定的DNA、RNA主要的核酸雜交技術(shù)有Southern blot和Nouthern blot，該技術(shù)主要有3個步驟：核酸的分離與純化、探針的制備和分子雜交。（2）聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR） 及 相 關(guān) 技 術(shù)：PCR是 一 種對指定的DNA片段在體外進行快速擴增的技術(shù)方法。在PCR基礎(chǔ)上，進一步發(fā)展了包括多重PCR（multiplex PCR）、實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）、 序 列 特 異 引 物PCR（Sequence Specific Primer，PCR-SSP）、 逆 轉(zhuǎn) 錄PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）等。（3）限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：RFLP是第一代DNA分子標(biāo)記技術(shù)，被用于基因組遺傳圖譜的構(gòu)建、基因的定位以及生物進化和分類等眾多領(lǐng)域的研究。利用同一種限制性內(nèi)切酶切割不同物種DNA序列時，可獲得不同長度、大小、數(shù)量的限制性酶切片段，再將這些片段電泳、轉(zhuǎn)膜、變性，并且與標(biāo)記過的探針進行雜交、洗膜，便可分析其多態(tài)性結(jié)果。（4）變性高效液相色譜分析（Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC）：DHPLC是一項新的雜合雙鏈突變檢測技術(shù)，能自動檢測單堿基替代以及小片段核苷酸的插入或缺失，可檢測基因的變異情況。（5）基因芯片技術(shù)：基因芯片是通過微量點樣技術(shù)等方法，對DNA樣品的序列信息進行高效的解讀和分析，從而對基因序列及其功能進行大規(guī)模高通量的研究，迅速而準(zhǔn)確的解讀遺傳信息。（6）新一代基因測序技術(shù)：新一代基因測序技術(shù)是一種和基因芯片技術(shù)互相補充的新的高通量測序方法，通常是指一個技術(shù)群，不同的新一代基因測序技術(shù)，在原理上存在較大的差別。主要包括：全基因組測序（Whole-Genome Sequencing，WGS）、全外顯子組測序（Whole-Exome Sequencing，WES）和目標(biāo)區(qū)域測序（Targeted Regions Sequencing，TRS）等。（7）熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）：FISH是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)，利用非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛）標(biāo)記探針，按照堿基配對原則進行雜交，借助熒光素偶聯(lián)的抗原抗體檢測系統(tǒng)，在鏡下對組織、細胞及染色體DNA或RNA進行定性、定量或相對定位分析。

2 2型糖尿病基因診斷的研究進展

2.1 單基因突變型糖尿病 單基因突變型糖尿病約占所有糖尿病患者的2%~5%，這種類型糖尿病的外顯率（即某人攜帶突變基因并發(fā)展成糖尿病的可能性）很高，為研究其發(fā)病機制提供了重要線索。（1）青少年發(fā)病的成人型糖尿?。∕aturity-Onset Diabetes of the Young，MODY）：MODY是單基因突變型糖尿病首先發(fā)現(xiàn)的類型，是一組遺傳異質(zhì)性的臨床疾病，其共同特征包括存在非酮癥糖尿病、常染色體顯性遺傳模式、胰島β細胞功能缺陷。根據(jù)突變基因可分為MODY1（HNF4A）、MODY2（GCK）、MODY3（TCF1）、MODY4（IPF1）、MODY5（TCF2）、MODY6（NeuroD1）、MODY7（KLF11）、MODY8（CEL），此外還包括由酶參與底物代謝所引起的突變型MODY及轉(zhuǎn)錄因子型MODY[5]。（2）線粒體糖尿病（Mitochondrial Diabetes）：線粒體糖尿病是母系遺傳性糖尿病，常伴有輕中度神經(jīng)性耳聾，常由編碼亮氨酸的tRNA的A3243G點突變引起。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體基因突變可導(dǎo)致胰島素的利用障礙[6-7]。（3）脂肪萎縮性糖尿?。褐疚s性糖尿病常與缺乏或缺少脂肪組織、重度胰島素抵抗、高脂血癥、脂肪肝等有關(guān)。脂肪萎縮性糖尿病有若干類型。其中，部分脂肪萎縮類型是由核纖層蛋白基因A/C（LMNA）突變引起的一種常染色體為主要形式的遺傳病。這類患者通常有過多的脂肪堆積在顏面和上半身，然而在軀干和下肢的脂肪含量卻逐漸減少。另外，小鼠胸腺瘤癌基因（AKT2）的突變參與了胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，鋅金屬蛋白酶（ZMPSTE24）參與了脂肪萎縮的過程，也被認為引起部分脂肪萎縮性糖尿病的原因之一[8]。（4）過氧化物酶體增生物激活受體（PPARγ）基因突變：PPARγ是核受體的PPAR的一種亞型。它是調(diào)控脂質(zhì)、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和細胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪組織中高度表達，也在胰島β細胞中表達。其與配體結(jié)合后和維甲酸X受體形成異源二聚體，結(jié)合特定的DNA，起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。PPARG基因突變可導(dǎo)致常染色體顯性脂肪萎縮綜合征并伴有早期糖尿病的癥狀。例如，Barroso與其同事在對重度胰島素抵抗和早期糖尿病的研究中，發(fā)現(xiàn)并報道了兩個顯性負突變基因（p467l和v290m），其突變體具有降低轉(zhuǎn)錄并抑制野生型PPARγ的作用。在對加拿大的一個患有家族性脂肪代謝障礙的家族的研究中發(fā)現(xiàn)，位于PPARγ配體結(jié)合域的雜合基因P388L存在突變[9-12]。

2.2 多基因突變型糖尿病 與單基因突變型糖尿病相比，多基因突變型糖尿病更為常見，過去的二三十年中，筆者在鑒定2型糖尿病基因突變的領(lǐng)域中付諸了巨大努力。候選基因分析法在三種基因（PPARG，KCNJ11，WFS1）中成功鑒定出增加2型糖尿病風(fēng)險的常見變異位點。全基因組連鎖分析在多個患有2型糖尿病的家族中鑒定出CAPN10和TCF7L2等基因。近期，全基因組關(guān)聯(lián)分析法（GWAS）對大量的單核苷酸多態(tài)性進行基因分型，成功鑒定出更多的與2型糖尿病相關(guān)的基因或染色體位點。目前，GWAS已成功鑒定出14個基因或位點，這些基因或位點的序列變異在人群中很常見，并且每個基因或位點變異都可增加2型糖尿病的患病風(fēng)險。

2.2.1 候選基因關(guān)聯(lián)分析法 目前已研究出上百個候選基因，其中可高度復(fù)制的候選基因有以下幾種。（1）內(nèi)向整流鉀通道亞家族11（KCNJ11）：ATP敏感性鉀通道（KATP）在胰島β細胞表達并且是調(diào)節(jié)胰島素分泌的關(guān)鍵因子。它由一個內(nèi)向整流鉀通道Kir 6.2與磺酰脲類受體（由ABCC8編碼）組成，Kir 6.2是染色體11p15.1上的KCNJ11基因編碼，KCNJ11突變屬罕見的激活突變。谷氨酸（E）的一個常見的錯義突變ABCC8取代賴氨酸（K）的23位點即（E23K）常被認為與2型糖尿病有關(guān)。有證據(jù)顯示，攜帶K23基因的患者有很大的可能性對磺脲類藥物產(chǎn)生繼發(fā)性失效[10-11]。（2）過氧化物酶體增生物激活受體（PPARγ）：PPARG的一個常見變異是脯氨酸被丙氨酸在12密碼子位點替換（P12A），丙氨酸的等位基因頻率在白種人中很高（0.11-0.19），而在非洲裔美國人中卻相對較低（0.02）。有研究表明，PPARG的丙氨酸12位點與降低2型糖尿病風(fēng)險有關(guān)，而脯氨酸12位點增加了胰島素抵抗及2型糖尿病的風(fēng)險[12]。（3）其他候選基因：WFS1突變導(dǎo)致的Wolfarin氏綜合征，可引起尿崩癥、糖尿病、視神經(jīng)萎縮和耳聾；HNF4A突變可引起MODY1等。

2.2.2 全基因組連鎖分析法 （1）轉(zhuǎn)錄因子7類似物2（TCF7L2）：利用全基因組連鎖分析法精細定位標(biāo)記后，發(fā)現(xiàn)在染色體10q25上，TCF7L2的四核苷酸DG10S478與T2DM的發(fā)生密切相關(guān)，其中TCF7L2是T細胞轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一。進一步的研究發(fā)現(xiàn)位于內(nèi)含子3上的rs7903146是一個高度可復(fù)制的變異位點，rs7903146等位基因增加了約1.4倍的2型糖尿病患病風(fēng)險，同時，TCF7L2在信號通路（WNT）中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖和變異，在腸內(nèi)分泌細胞，信號通路通過TCF7L2影響胰高素血糖樣肽-1（GLP-1）的分泌[13]。（2）鈣蛋白酶10（CAPN10）：通過全基因組連鎖分析法，在CAPN10上鑒定出3個常見的可增加2型糖尿病患病風(fēng)險的變異位點。CAPN10編碼鈣調(diào)節(jié)的半胱氨酸蛋白酶，并在多個組織廣泛表達。有研究證實，該基因上的變異與2型糖尿病有關(guān)。然而，CAPN10是如何影響2型糖尿病的患病風(fēng)險還不得而知，但鑒于此酶的廣泛表達，其可能是通過影響胰島素抵抗和胰島素分泌發(fā)揮作用[14]。

2.2.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析法（GWAS） Sladek和同事首次報道了一個存在于染色體8q24.11上的基因SLC30A8，其可增加2型糖尿病患病風(fēng)險，還可編碼鋅轉(zhuǎn)運體8（ZNT8），而ZTN8主要表達于胰島β細胞，這一發(fā)現(xiàn)隨后也在其他的GWAS研究中被證實[15]。GWAS研究證實，葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白基因GCKR與空腹血清甘油三酯水平有關(guān)，位于GCKR上的一個突變基因P336L與甘油三酯水平、降低空腹血糖水平及降低2型糖尿病患病風(fēng)險有關(guān)。有研究表明，位于染色體3q27的胰島素樣生長因子2結(jié)合蛋白2（IGF2BP2）的基因突變與2型糖尿病有關(guān)，可增加2型糖尿病的患病風(fēng)險[16]。FTO是一個與脂肪量和肥胖相關(guān)的基因，位于染色體16q12，其在2型糖尿病患病風(fēng)險方面的作用基于身體質(zhì)量指數(shù)的高低[17]。最近，GWAS研究鑒定出一個新的亞洲人口的2型糖尿病易感基因KCNQ1，位于染色體11p15.5，主要表達于心臟，少量表達在其他組織如胰腺、肝臟和脂肪組織等，其在增加2型糖尿病的風(fēng)險的同時還可引起長QT間期綜合征[18]。其他一些GWAS研究也分別證實了一些與2型糖尿病有關(guān)的基因，包括CDKAL1、CDKN2A、CDKN2B、HHEX、KIF11、IDE 等[19-20]。

3 討論

自從1993以來，筆者對于糖尿病的遺傳基礎(chǔ)的認識有了顯著進步，一些在人群中相對罕見的包含突變點的基因，在基因表型上起重要作用，可以引起單基因型糖尿病。攜帶這些突變基因的人群有很高的糖尿病發(fā)病率。然而，這類人群也僅占糖尿病總?cè)藬?shù)的一小部分，這些基因的發(fā)現(xiàn)揭示了葡萄糖穩(wěn)態(tài)新的通路和機制。

目前GWAS芯片對2型糖尿病基因變異的檢測，多數(shù)局限于白種人。未來，GWAS、外顯子組和全基因組測序研究還需要兼顧分析其他人群和其他種類的遺傳變異。隨著高通量、低成本以及樣本量的增加，人類在解開2型糖尿病復(fù)雜的遺傳結(jié)構(gòu)的進程中將會呈現(xiàn)前所未有的飛越。

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