張文萍　甘夢月　馬妍妮　黨宏萬

[摘要] 目的 建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測定大鼠血漿中阿霉素的血藥濃度，并用于阿霉素載藥納米粒的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究。 方法 色譜柱采用Shim-pack XR-ODS柱（2.0 mm×100 mm，2.2 μm），儀器采用API 4000三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，采用多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）定量離子對(duì)為m/z544.2→m/z396.9（阿霉素）和m/z357.3→m/z133.8（吡格列酮，內(nèi)標(biāo)）；甲醇沉淀蛋白法處理樣品。 結(jié)果 阿霉素在2.0～2000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為2.0 μg/L，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾阿霉素的測定；日內(nèi)和日間精密度RSD均小于±15.0%；阿霉素低、中、高3個(gè)QC濃度的提取回收率分別為（92.1±5.9）%、（82.8±2.9）%和（80.1±9.7）%，基質(zhì)效應(yīng)分別為（91.1±2.4）%、（82.1±1.7）%和（81.2±2.5）%。 結(jié)論 該方法適用于阿霉素納米粒在大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究。

[關(guān)鍵詞] 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；阿霉素；藥動(dòng)學(xué)研究；含量測定

[中圖分類號(hào)] R969.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）12（b）-0055-05

阿霉素主要通過嵌入DNA而抑制核酸的合成，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，屬周期非特異性藥物，對(duì)各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用[1]。由于心臟毒性較大，在實(shí)體瘤內(nèi)部滲透性差，臨床應(yīng)用受到極大的限制[2-3]。由于納米給藥系統(tǒng)具有靶向性、緩釋性、降低藥物毒性和提高藥物穩(wěn)定性等特點(diǎn)，阿霉素的納米靶向傳遞是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[4-5]。由于納米制劑給藥量小，需要建立靈敏、高效的體內(nèi)藥物濃度測定方法進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究。目前，阿霉素的體內(nèi)測定方法主要有HPLC-UV[6]、熒光光度法[7-8]、HPLC-FLU[9-12]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）[13-15]等方法，以熒光檢測方法為主，液相-質(zhì)譜聯(lián)用法報(bào)道較少。其中HPLC-UV、熒光光度法和HPLC-FLU檢測靈敏度低，LC-MS/MS多采用液液萃取的提取方法，樣品處理較復(fù)雜，且血漿用量大，分析時(shí)間較長，且用于阿霉素納米制劑藥動(dòng)學(xué)研究的較少。本文旨在建立一種簡便快速、專屬性強(qiáng)的LC-MS/MS法測定大鼠血漿中阿霉素的血藥濃度，并將其應(yīng)用于阿霉素載藥納米粒的藥物動(dòng)力學(xué)研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

API 4000串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國Applied Bio-systems公司），LC-30A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），Eppendorf AG5804R低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司），XW-80A渦旋混合器（姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司），梅特勒AE240電子天平（Mettler托利多儀器上海有限公司），Milli-Q ADVANTAGEA10純水儀（Merck Millipore公司），DW-86L628醫(yī)用低溫箱（青島海爾特種電器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸阿霉素（純度>98.89%，上海寶曼生物科技有限公司，批號(hào)20120715），鹽酸吡格列酮（含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.55%，濟(jì)南中科一通化工有限公司，批號(hào)2011 0904），阿霉素載藥納米粒 （含量0.6 g/L，寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院臨床藥理研究室制備）。色譜甲醇、乙腈（美國Fisher公司）。

1.3 動(dòng)物

6只SD大鼠，雄性，平均體重約為230 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK（寧）2011-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制及樣品處理

2.1.1 溶液配制 精密稱取鹽酸阿霉素10.7 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后并定容，配制相當(dāng)于阿霉素濃度為1.00 g/L的溶液。用甲醇水（1∶1）稀釋濃度為2、4、10、20、100、400、1000、2000 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及濃度分別為5、80、1600 μg/L的質(zhì)量控制（QC）溶液，置于-4℃冰箱備用。

精密稱取鹽酸吡格列酮11.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后并定容，配制相當(dāng)于吡格列酮濃度為1.00 g/L的溶液。取上述儲(chǔ)備液用甲醇水（1∶1）稀釋至濃度為15 μg/L的內(nèi)標(biāo)溶液，置于-4℃冰箱備用。

2.1.2 血漿樣品處理 取大鼠血漿50 μL，置于1.5 mL EP管中，加入50 μL 15 μg/L吡格列酮溶液，50 μL甲醇水（1∶1），渦旋30 s，加入250 μL甲醇，渦旋2 min，4℃離心10 min（14 000 r/min），取上清液10 μL進(jìn)樣。

2.2 測定條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：（Shim-pack XR-ODS（2.0 mm×100 mm，2.2 μm）；保護(hù)柱：Shim-pack GVP-ODS（2.0 mm×5 mm，2.2 μm）；流動(dòng)相：A相（0.1%冰醋酸），B相（甲醇），采用梯度洗脫，0～0.2 min，40%B相；0.2～0.8 min，80%B相；0.8～3.0 min，80%B相；3.0～3.5 min，40%B相，4.0 min結(jié)束，流速為0.2 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源：Turbo Spray；碰撞氣6 psi；氣簾氣10 psi；霧化氣60 psi；輔助加熱氣30 psi；離子噴霧電壓4000 V；離子源溫度350°C；去簇電壓56 V；Q0電壓10 V；碰撞能量15 V；碰撞池出口電位12 V。正離子模式檢測；MRM監(jiān)測。定量離子對(duì)為m/z 544.2→m/z 396.9（阿霉素）和m/z 357.3→m/z 133.8（吡格列酮，內(nèi)標(biāo)），二級(jí)掃描質(zhì)譜圖見圖1。

2.3 分析方法確證

2.3.1 專屬性 分別取6種不同來源的大鼠空白血漿各50 μL，置于1.5 mL EP管中，其中以50 μL甲醇水（1∶1）代替內(nèi)標(biāo)溶液，50 μL甲醇水（1∶1）代替阿霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，其余按照“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，測定后為空白血漿樣品色譜圖（圖2A）。

取空白大鼠血漿50 μL，置于1.5 mL EP管中，將質(zhì)量濃度為2.0 μg/L的阿霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液（15 μg/L）加入空白血漿中，其余按照“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，測定后為含藥血漿樣品色譜圖（圖2B）。其中，阿霉素和吡格列酮的保留時(shí)間分別約為2.58 min和3.19 min。

取大鼠給藥后4 h采集的血漿樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，測定后為實(shí)際血漿樣品色譜圖（圖2C）。如圖所示，大鼠血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)阿霉素及吡格列酮測定無干擾，說明本方法專屬性良好。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍 取6 份空白大鼠血漿各50 μL，分別加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，再加入阿霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成阿霉素濃度為2、4、10、20、100、400、1000、2000 μg/L的含藥血漿樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下處理后測定；以阿霉素濃度為橫坐標(biāo)，阿霉素與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，得到典型回歸方程為：A=0.00528C-0.00593，r=0.9976。結(jié)果表明，阿霉素在2.0～2000 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為2.0 μg/L，可以滿足大鼠血漿中阿霉素濃度的測定。

2.3.3 精密度與準(zhǔn)確度 取大鼠空白血漿50 μL，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備濃度為2.0 μg/L的阿霉素定量下限樣品6份，按血漿樣品處理方法處理后測定，日內(nèi)精密度RSD為13.4%，準(zhǔn)確度為-2.3%。

取大鼠空白血漿50 μL，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備阿霉素濃度分別為5、80、1600 μg/L的QC樣品，每濃度平行制備6樣本，連續(xù)測定3 d，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度與準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。由表1可知本方法精密度與準(zhǔn)確度良好。

2.3.4 提取回收率 提取樣品的制備（EX QC）：取6種不同來源的空白大鼠血漿50 μL，按“2.3.2”項(xiàng)下方法配制阿霉素濃度為5、80、1600 μg/L的QC樣品，每濃度平行制備6樣本，進(jìn)樣分析，記錄相應(yīng)的色譜峰面積。

未經(jīng)提取樣品的制備（NEX QC）：同時(shí)另取6種不同來源的大鼠空白血漿各50 μL，加入甲醇溶液250 μL，渦旋2 min，離心10 min（14 000 r/min），吸取上清液，加入5、80、1600 μg/L的QC溶液50 μL，內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，混勻，進(jìn)樣分析，每濃度平行制備6樣本，記錄相應(yīng)的色譜峰面積。

提取回收率計(jì)算：以每一濃度EX樣本測定所得的分析物峰面積除以NEX樣本測定所得的分析物峰面積，同一來源血漿一對(duì)一求比值，計(jì)算對(duì)3個(gè)QC濃度的分析物于6個(gè)不同來源的血漿基質(zhì)中的提取回收率，RSD應(yīng)不大于15%；以EX樣本測定所得的內(nèi)標(biāo)峰面積除以NEX樣本測定所得的內(nèi)標(biāo)峰面積，同一QC濃度的同一來源血漿一對(duì)一求比值，計(jì)算對(duì)工作濃度的內(nèi)標(biāo)的提取回收率，RSD應(yīng)不大于15%。

阿霉素低、中、高3個(gè)QC濃度的提取回收率分別為（92.1±5.9）%、（82.8±2.9）%和（80.1±9.7）%，內(nèi)標(biāo)提取回收率為（91.6±12.0）%，RSD均≤12.0%，結(jié)果可知提取回收率良好。

2.3.5 基質(zhì)效應(yīng) 含有基質(zhì)樣品的制備：同“2.3.4”項(xiàng)下未經(jīng)提取樣品的制備方法操作。

無基質(zhì)樣品的制備（溶液W樣本）：取純水50 μL代替空白血漿，分別加入50 μL IS溶液、50 μL阿霉素濃度為5、80、1600 μg/L的QC標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入250 μL甲醇，每濃度各6樣本，渦流后測定，記錄相應(yīng)的色譜峰面積。

基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算：以每一濃度NEX樣本測定所得的分析物峰面積除以W樣本測定所得的分析物平均峰面積，計(jì)算6個(gè)不同來源的血漿基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)3個(gè)QC濃度的分析物的基質(zhì)效應(yīng)，RSD應(yīng)不大于15%；以NEX樣本測定所得的內(nèi)標(biāo)峰面積除以W樣本測定所得的內(nèi)標(biāo)平均峰面積，計(jì)算內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)工作濃度的內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)，RSD應(yīng)不大于15%。

阿霉素低、中、高3個(gè)QC濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為（91.1±2.4）%、（82.1±1.7）%和（81.2±2.5）%，內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)為（109.0±10.0）%，結(jié)果符合規(guī)定[16]。

2.3.6 穩(wěn)定性 按“2.3.2”項(xiàng)下方法分別配制阿霉素濃度為5、80和1600 μg/L的含藥血漿樣品，考察阿霉素血漿樣品在室溫放置12 h穩(wěn)定性、樣品處理后放置24 h穩(wěn)定性、-70℃ 3次凍融穩(wěn)定性以及-70℃長期放置30 d穩(wěn)定性。結(jié)果如表2所示，阿霉素在以上條件下穩(wěn)定性良好。

2.4 生物樣品測定

2.4.1 給藥方案及血漿樣品采集 6只健康SD大鼠，雄性，平均體重約為230 g，分別尾靜脈注射阿霉素載藥納米粒，給藥劑量為5 mg/kg。給藥后分別在0.087、0.167、0.25、0.33、0.5、1、2、4、6、10、24、48、72 h眼眶取血0.5 mL，取血后立即移入經(jīng)肝素處理的試管中，4℃離心10 min（14 000 r/min），分離血漿，于-70℃冰箱中冷凍，待分析。

2.4.2 血漿樣品測定 血漿樣品的處理按照“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)血漿中阿霉素的濃度，同時(shí)測定濃度為5、80、1600 μg/L的QC樣品。血藥濃度-時(shí)間曲線如圖3所示。

2.4.3 藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算 采用DAS 3.0藥動(dòng)學(xué)軟件處理，非隔室模型法計(jì)算阿霉素載藥納米粒注射后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。其中AUC0-t為（2585±273）μg·h/L，AUC0-∞為（2854±240）μg·h/L，ke為（0.03±0.01）/h，t1/2為（28.40±7.27）h，tmax為（0.08±0.00）h，V為（71.87±18.07）L/kg，血漿清除率為（1.76±0.15）L/（h·kg），Cmax為（3253±968）μg/L。

3 討論

3.1 液相條件的考察

有機(jī)相為甲醇時(shí)，阿霉素的響應(yīng)比用乙腈時(shí)高約1.5倍；水相為0.1%冰醋酸時(shí)，阿霉素的響應(yīng)比0.1%甲酸高約1.2倍；采用梯度洗脫時(shí)，阿霉素和內(nèi)標(biāo)的峰形良好，無拖尾。最終確定以甲醇-0.1%冰醋酸作為水相，甲醇作為有機(jī)相，梯度洗脫。

3.2 測定方法的比較

文獻(xiàn)中雖然已有LS-MS/MS法測定阿霉素體內(nèi)濃度的報(bào)道[13-15]，但多采用氯仿-甲醇（4∶1）和乙酸乙酯進(jìn)行液液萃取，樣品處理較復(fù)雜，且血漿用量大，本研究只需要大鼠血漿50 μL，文獻(xiàn)中分別使用200 μL和400 μL，是本研究的4倍和8倍。雖然定量下限最低可以達(dá)到1.0 μg/L，但血漿樣品處理方法比較復(fù)雜，采用乙腈沉淀蛋白后，將上清液取出用氮?dú)獯蹈?，再用流?dòng)相復(fù)溶，靈敏度雖高，但制樣過程時(shí)間較長；同時(shí)，阿霉素的出峰時(shí)間為4.9 min，約為本研究的2倍。本研究采用甲醇直接沉淀蛋白，處理方法簡單，阿霉素在給藥后2.58 min左右出峰，大大縮短了分析時(shí)間。

本研究建立的大鼠血漿中阿霉素濃度測定的LC-MS/MS法，樣品處理方法簡單、專屬性強(qiáng)、分析時(shí)間快，能夠滿足阿霉素納米粒在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究。

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（收稿日期：2014-08-10 本文編輯：程 銘）