蘇軍紅　祁秀峰　申向輝　趙麗香　胡彥峰　王偉

[摘要] 目的 觀察由魚藤酮制備的帕金森?。≒D）大鼠模型黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元中氧化應(yīng)激參數(shù)、轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子（Nrf2）及其基因產(chǎn)物血紅素氧合酶1（HO-1）和依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶1（NQO1）的表達(dá)變化情況。 方法 將健康成年雄性Wistar大鼠40只隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，20只對照組大鼠給予背部皮下注射葵花油[1 mL/（kg·d）]，20只實(shí)驗(yàn)組大鼠，按照2.0 mg/（kg·d）背部皮下注射魚藤酮（魚藤酮溶解在葵花籽油中）制備PD大鼠模型，共30 d。最后一次注射結(jié)束后實(shí)驗(yàn)大鼠迅速斷頭取材，采用分光光度法檢測大鼠腦內(nèi)紋狀體中丙二醛（MDA）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量變化，采用Western blot檢測兩組大鼠中腦黑質(zhì)中Nrf2、HO-1和NQO1的表達(dá)。 結(jié)果 對照組和實(shí)驗(yàn)組腦內(nèi)紋狀體中MDA含量分別為（6.51±1.45）、（18.13±2.14）nmol/mgprot，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠紋狀體中MDA升高了64.09%（P < 0.01）。對照組和實(shí)驗(yàn)組紋腦內(nèi)狀體中GSH含量分別為（44.53±4.71）、（26.41±2.52）mg/gprot，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠紋狀體中GSH降低了40.69%（P < 0.01）。對照組大鼠中腦黑質(zhì)中Nrf2、HO-1和NQO1與β-actin免疫印跡條帶相對吸光度比值分別為（0.81±0.05）、（0.84±0.07）和（0.91±0.15），實(shí)驗(yàn)組大鼠中腦黑質(zhì)中Nrf2、HO-1和NQO1與β-actin免疫印跡條帶相對吸光度比值分別為（0.42±0.06）、（0.49±0.03）和（0.33±0.04）。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元中Nrf2、HO-1和NQO1表達(dá)分別降低了48.15%、41.67%和63.74%（P < 0.01）。 結(jié)論 氧化應(yīng)激在PD發(fā)病中起著非常重要的作用，內(nèi)源性抗氧化損傷通路Nrf2-ARE與PD的發(fā)病關(guān)系密切，可能是PD新的治療靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 帕金森??；氧化應(yīng)激；轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子-抗氧化反應(yīng)元件；血紅素氧合酶1；依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶1

[中圖分類號] R742.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）12（b）-0008-04

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是中老年人群中較為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要的特征性病理變化是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性壞死及Lewy小體形成，導(dǎo)致腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)含量減少，主要臨床癥狀為運(yùn)動障礙，表現(xiàn)為靜止性震顫、肌張力增高、運(yùn)動遲緩等。既往研究結(jié)果表明，許多慢性疾病都與人體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激導(dǎo)致體內(nèi)累積過多的氧自由基有關(guān)，氧自由基在PD中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡過程中起著非常至關(guān)重要的作用，抗氧化治療PD已成為新療法中的重要研究方向[1-2]。

轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，通過與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）相互作用調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)。Nrf2是機(jī)體調(diào)節(jié)抗氧化反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，正常情況位于細(xì)胞漿中，在細(xì)胞漿中與Keapl結(jié)合形成復(fù)合體，且被泛素蛋白酶迅速降解，從而保持其低活性的生理狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體受到氧自由基和內(nèi)源性毒素等攻擊后Nrf2與Keapl解離，其半衰期明顯延長，然后轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合后誘導(dǎo)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因的表達(dá)。Nrf2-ARE通路是目前發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化損傷通路之一。

血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）和依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶1[NAD（P）H：quinone oxidoreductase-1，NQO1]是Nrf2-ARE通路編碼的內(nèi)源性保護(hù)基因，在抗氧化損傷方面起著重要作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)上調(diào)HO-1和NQO1的表達(dá)，能夠減少氧自由基和內(nèi)源性毒素對神經(jīng)元的毒性作用。既往研究證實(shí)，激活Nrf2-ARE信號通路上調(diào)其基因產(chǎn)物的表達(dá)對神經(jīng)系統(tǒng)疾病如癲癇、腦出血、腦梗死和腦外傷等，具有很強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)功能[2]。但是，Nrf2-ARE信號通路在PD發(fā)病中表達(dá)改變還未見明確相關(guān)報(bào)道。本研究利用魚藤酮制備PD大鼠模型，觀察大鼠腦內(nèi)黑質(zhì)中Nrf2及其基因產(chǎn)物HO-1和NQO1的表達(dá)改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組和動物模型的制備

雄性Witstar大鼠40只，體重250～300 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將40只Witstar大鼠隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組；20只對照組大鼠給予背部皮下注射葵花油1 mL/（kg·d），20只實(shí)驗(yàn)組大鼠，按照2.0 mg/（kg·d）背部皮下注射魚藤酮（魚藤酮溶解在葵花籽油中，充分震蕩混勻后4℃避光保存），共30 d。大鼠飼養(yǎng)于晝夜交替的環(huán)境中，期間自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物腦內(nèi)紋狀體中氧化應(yīng)激參數(shù)丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）含量測定

最后1次藥物注射結(jié)束后24 h，大鼠直接斷頭取腦，在冰盤上迅速分離紋狀體，4℃生理鹽水沖洗血液，液氮速凍，于-80℃低溫冰箱保存用于測量氧化應(yīng)激參數(shù)（MDA和GSH）。具體實(shí)驗(yàn)方法按所購試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 Western blott檢測兩組大鼠中腦黑質(zhì)中Nrf2、HO-1和NQO1的表達(dá)

最后1次藥物注射結(jié)束后24 h，大鼠直接斷頭取腦，在冰盤上迅速分離黑質(zhì)所在腦塊，4℃生理鹽水沖洗血液，入液氮速凍后置-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。取所需腦組織入4℃裂解液勻漿5 min，冰浴靜置1 h，4℃ 2000 r/min離心5 min，取上清，Bradford法測定蛋白濃度。相關(guān)樣品取50 μg總蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，依照實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆謩e加入5%脫脂奶粉稀釋的兔Nrf2、HO-1和NQO1單克隆抗體（1∶1000），4℃過夜。PVDF膜以TTBS洗3次。山羊抗兔IgG 熒光抗體（1∶10000，Rocland公司）室溫避光1 h，漂洗5次，遠(yuǎn)紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（Odyssey公司） 掃描并測定目標(biāo)蛋白單位光密度值，與β-actin（1∶5000，Santa Cruz）比值后，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠毛色變黃、變臟，體態(tài)呈弓背狀，行為上表現(xiàn)為主動活動減少、動作遲緩、步態(tài)不穩(wěn)、行走時(shí)多向一側(cè)旋轉(zhuǎn)。兩組在第10、13、15、19 d時(shí)各死亡1只大鼠。

2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠紋狀體中氧化應(yīng)激參數(shù)的改變

實(shí)驗(yàn)組腦內(nèi)紋狀體中MDA含量與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠紋狀體中MDA升高了64.09%（P < 0.01）。實(shí)驗(yàn)組紋腦內(nèi)狀體中GSH含量與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠紋狀體中GSH降低了40.69%，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。

2.3 Nrf2、HO-1和NQO1在實(shí)驗(yàn)大鼠黑質(zhì)中的表達(dá)

與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元中Nrf2、HO-1和NQO1表達(dá)分別降低了48.15%、41.67%和63.74%，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表2、圖1。

3 討論

PD是中老年人群中比較常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要的病理改變是中腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元漸進(jìn)性受損，導(dǎo)致腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)含量減少，從而出現(xiàn)一系列以運(yùn)動障礙為主要表現(xiàn)的臨床綜合征?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域近年的研究結(jié)果表明，許多慢性疾病都與人體內(nèi)累積過多的自由基有關(guān)，PD與自由基及氧化應(yīng)激之間的關(guān)系日益成為人們研究的熱點(diǎn)。目前大量的研究證實(shí)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧自由基損傷為PD發(fā)病的重要病理機(jī)制[3-4]。機(jī)體生理狀態(tài)下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)，當(dāng)這種平衡被打破，自由基蓄積過多，就會導(dǎo)致氧化損傷，即所謂氧化應(yīng)激。氧化損傷使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA過氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5-6]。眾所周知，中樞神經(jīng)系統(tǒng)含有豐富的脂質(zhì)成分，耗氧量最高且抗氧化酶相對缺乏，所以對自由基損傷特別敏感[7]。綜上所述，本研究組有理由認(rèn)為抗氧化、清除氧自由基的治療方法能為PD的藥物治療提供新的靶點(diǎn)。

魚藤酮是來源于自然界中某些植物根莖的天然殺蟲劑，近年被廣泛應(yīng)用于果蔬和池塘殺蟲等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。最近研究發(fā)現(xiàn)，魚藤酮對中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元具有明顯的神經(jīng)毒性作用[8]，大鼠長期接觸魚藤酮可出現(xiàn)PD樣癥狀及帕金森病理性改變[9]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)魚藤酮處理后實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)毛色變臟、自主活動減少、弓背屈曲姿勢、行走時(shí)向一側(cè)旋轉(zhuǎn)等PD樣癥狀，前期的研究已經(jīng)證實(shí)，大鼠腦內(nèi)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量明顯較少[10]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)大鼠腦內(nèi)紋狀體中脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA含量明顯增高，自由基清除劑GSH含量明顯降低，表明大鼠腦內(nèi)氧化平衡被破壞，發(fā)生了氧化應(yīng)激損傷。

Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，與ARE結(jié)合調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞對氧化應(yīng)激的抵抗能力，即Nrf2-ARE通路在這些機(jī)體防御機(jī)制中起著非常重要的作用[11-12]。Nrf2-ARE通路在抗感染、抗凋亡、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗缺血再灌注損傷、肺纖維化和神經(jīng)保護(hù)等方面發(fā)揮著廣泛的細(xì)胞保護(hù)功能。到目前為止，已證實(shí)經(jīng)Nrf2-ARE信號路徑調(diào)節(jié)的可編碼內(nèi)源性保護(hù)基因超過200個(gè)[13-14]。這些保護(hù)性基因包括抗氧化蛋白類基因、Ⅱ相解毒酶基因、分子伴侶類和抗炎因子類基因等。他們在增強(qiáng)組織抗氧化能力、保護(hù)組織免受毒物損傷、抗腫瘤、抗感染、抗凋亡中起著重要的作用。其中Nrf2-ARE通路的基因產(chǎn)物HO-1和NQO1在神經(jīng)保護(hù)方面的作用尤其重要。近年研究證實(shí)，在脊髓側(cè)索硬化、癲癇、腦梗死、腦出血等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中上調(diào)Nrf2、HO-1或者NQO1的表達(dá)能起到神經(jīng)保護(hù)作用[15-17]，但是在PD大鼠模型中Nrf2、HO-1和NQO1的表達(dá)改變還未見明確報(bào)道。

綜上所述，本研究證實(shí)，在PD大鼠模型腦內(nèi)氧化平衡狀態(tài)被破壞，脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA生成增加，自由基清除劑GSH含量減少。同時(shí)發(fā)現(xiàn)中腦黑質(zhì)中Nrf2、HO-1和NQO1的表達(dá)明顯降低，這表明該抗氧化防御體系受到破壞，這可能是加重黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷的原因之一。Nrf2-ARE通路與PD的發(fā)病密切相關(guān)，激活該通路，誘導(dǎo)其基因產(chǎn)物的表達(dá)能夠保護(hù)中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，從而延緩PD的病情進(jìn)展，后期將會進(jìn)一步研究證實(shí)該推斷。

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（收稿日期：2014-09-12 本文編輯：任 念）