宋業(yè)旭，贠捷，馬曉鵬，裴春鵬，金麗霞，趙大鵬，馬艷春，宋立群

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

·綜述·

基于iTRAQ技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于慢性腎臟病研究的進展

宋業(yè)旭1，贠捷2，馬曉鵬2，裴春鵬2，金麗霞2，趙大鵬2，馬艷春1，宋立群2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

自1994年蛋白質(zhì)組學(xué)的概念被提出以來，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)應(yīng)用在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域，并成為“后基因時代”的研究熱點。蛋白質(zhì)作為生物功能的具體執(zhí)行者，對其的表達(dá)水平、翻譯后修飾、轉(zhuǎn)運定位、蛋白質(zhì)之間相互作用及蛋白與其他生物分子相互作用的研究，可以獲得蛋白質(zhì)水平上的對疾病發(fā)生機制、臨床診斷、藥物治療機制等方面的認(rèn)識[1-2]。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

對蛋白質(zhì)進行研究的主要內(nèi)容是蛋白質(zhì)的分離、鑒定和定量研究。對蛋白質(zhì)的定性研究常用的是蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定(如MALDI-TOF/TOF、LC-ESI-MS/MS)和Shotgun混合蛋白質(zhì)鑒定。對蛋白質(zhì)定量研究包括凝膠路線(如2D雙向凝膠電泳和DIGE熒光差異雙向凝膠電泳)、質(zhì)譜路線(如Label free非標(biāo)記質(zhì)譜定量、iTRAQ質(zhì)譜定量、SILAC質(zhì)譜定量、SRM /MRM目標(biāo)蛋白絕對定量)。對蛋白質(zhì)修飾分析常用技術(shù)如修飾肽段富集LC-MS/MS。

2 相對和絕對定量同位素標(biāo)記(iTRAQ)技術(shù)原理

2004年美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司推出一項新的體外同位素標(biāo)記技術(shù)，即iTRAQ。iTRAQ試劑分為4標(biāo)和8標(biāo)兩種，其原理是采用與氨基反應(yīng)等量的異位標(biāo)簽，通過與多臺氨基基團共價反應(yīng)而達(dá)到標(biāo)記的作用。以8標(biāo)試劑為例，其標(biāo)簽分子量為145，由報道基團(相對分子量分別為121、119、118、117、116、115、114、113)、質(zhì)量平衡臂(質(zhì)量分別為24、26、27、28、29、30、31、32)和一個相同的多肽反應(yīng)基團組成。因此在進行質(zhì)譜鑒定時，標(biāo)記后第一級質(zhì)譜檢測時，其分子量完全相同。進行第二級質(zhì)譜分析時，不同同位素標(biāo)簽可產(chǎn)生不同信號離子。通過蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫搜索標(biāo)記后多肽肽鍵斷裂所產(chǎn)生的離子串，可確定蛋白質(zhì)前體組成，并通過測定信號離子豐度檢測樣本中蛋白豐度。

3 iTRAQ技術(shù)的優(yōu)勢

盡管傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳(2-DE)方法應(yīng)用比較廣泛，但雙向電泳本身的局限性，比如疏水性蛋白和膜蛋白難以溶解，低豐度蛋白受到高豐度蛋白的影響，極酸或及極堿性蛋白受到一維固相pH梯度等電聚焦和電滲流等問題的影響，小分子量蛋白可能與有力的十二烷基磺酸鈉離子對流混合，故難以檢測出疏水性蛋白、膜蛋白、低豐度蛋白、極性蛋白、小分子量蛋白等。

iTRAQ試劑最多可同時對8組樣品的蛋白進行定量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，提高了組間分析的準(zhǔn)確性。iTRAQ的標(biāo)記機制對蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點沒有影響，可達(dá)到對蛋白質(zhì)翻譯后修飾如磷酸化、泛素化等方面研究的要求。最重要的是iTRAQ所需樣本來源廣泛，細(xì)胞、組織、血漿、血清、尿液，甚至唾液、腦脊液、淚液、鼻分泌物等均可作為檢測樣本，便于篩選臨床診斷指標(biāo)的研究。

有研究[3-4]分別用2-DE分離差異蛋白點和iTRAQ標(biāo)記樣本后使用MALD ITOF/TOF串聯(lián)飛行質(zhì)譜對背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進行蛋白的鑒定，結(jié)果顯示2-DE方法分離出4種差異蛋白，而iTRAQ技術(shù)發(fā)現(xiàn)22中蛋白的變化，其中2-DE鑒定出的4種上調(diào)蛋白為結(jié)構(gòu)蛋白和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，且蛋白量的變化都在2倍以上，而iTRAQ技術(shù)鑒定的22中上調(diào)蛋白為結(jié)構(gòu)蛋白、信號蛋白、代謝蛋白、降解蛋白、細(xì)胞基質(zhì)蛋白等，蛋白變化在1.3～1.6之間。說明iTRAQ技術(shù)在鑒定和比較總蛋白的數(shù)量和種類上有明顯的優(yōu)勢。Wu等[4]通過比較DIGE、ICAT及iTRAQ三種蛋白定量方法研究已知蛋白混合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種方法都能對蛋白混合物準(zhǔn)確定量，但iTRAQ是最敏感的定量方法。

4 iTRAQ技術(shù)在腎臟疾病方面的應(yīng)用

目前iTRAQ在腎臟疾病方面的應(yīng)用主要集中在尋找臨床診斷標(biāo)記物方面。Overgaard等[5]將123名1型糖尿病患者按尿蛋白量分成三組，分別為無蛋白尿組、微量蛋白尿組(尿微量蛋白在30～300 mg/24 h)、大量蛋白尿即糖尿病腎病組(尿微量蛋白大于300 mg/24 h)。將三組患者血清樣本混合成三份樣本，并用iTRAQ試劑標(biāo)記，納升液相色譜儀進行蛋白質(zhì)鑒定，通過Proteome Discoverer軟件處理數(shù)據(jù)，IPA軟件分析蛋白質(zhì)功能通路。實驗鑒定出112個差異蛋白，通過研究差異蛋白之間的關(guān)系，認(rèn)為糖尿病腎病的進展和心血管并發(fā)癥的發(fā)生與脂蛋白A2、B、C3、D和E關(guān)系密切，并通過多重免疫分析方法選取糖尿病腎病快速進展和緩慢進展的患者對iTRAQ結(jié)果進行驗證，認(rèn)為所發(fā)現(xiàn)的差異蛋白中可能作為對糖尿病腎病的早期診斷和預(yù)后的生物標(biāo)記物。王玉等[6]通過iTRAQ標(biāo)記的二維液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜連用技術(shù)檢測臨床患者尿液蛋白質(zhì)組學(xué)，并比較以腎病綜合征為主要表現(xiàn)的30例患者的尿液。按其病理改變不同分為兩組，15例為膜性腎病組，15例為局灶節(jié)段性腎小球硬化組，隨機將組內(nèi)每5人尿液合為一個樣本并清除白蛋白/IgG抗體，在總共6組樣品中共鑒定出809個蛋白，其中豐度排名前十位的蛋白涉及代謝、細(xì)胞活動、發(fā)育調(diào)控、免疫刺激反應(yīng)等多個方面，差異蛋白共鑒定出16個，涉及纖溶、免疫反應(yīng)、代謝、細(xì)胞增生等過程。有研究[7-9]結(jié)合iTRAQ標(biāo)記并采用高效液相-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析三例病理診斷為V型狼瘡性腎炎患者腎組織，并與正常組(1例為腎腫瘤患者遠(yuǎn)離病灶的正常腎組織和2例非腎性血尿患者腎組織)相對比，共鑒定出512個蛋白，篩選出18個顯著差異蛋白，認(rèn)為其差異蛋白質(zhì)的主要功能是激酶和氧化還原酶。

5 展望

使用iTRAQ標(biāo)記的腎臟蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究還處于起步階段。iTRAQ結(jié)合多維液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)也有一定的局限性，比如iTRAQ試劑幾乎可以與樣本中所有蛋白質(zhì)相結(jié)合，易受樣本中雜質(zhì)蛋白污染，所得的數(shù)據(jù)需要復(fù)雜的生物信息學(xué)工具才能進行分析，而且每次實驗都必須鑒別全部的蛋白質(zhì)組。當(dāng)前iTRAQ在腎臟疾病方面的應(yīng)用主要集中在尋找臨床診斷標(biāo)記物方面，對藥物作用靶點、疾病機制等方面的應(yīng)用尚不完善，因此，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究，相信應(yīng)用iTRAQ技術(shù)必將為了解蛋白質(zhì)在腎臟疾病中的作用做出積極的貢獻。

[1] Ross PL,Huang YN,Marchese JN,et al.Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents[J].Mol & cell prot,2004,3(12):1154-1169.

[2] Harry JL,Wilkins MR,Herbert BR,et al.Proteomics:capacity versus utility[J].Electrophoresis,2000,21(6):1071-1081.

[3] 潘三強,宿寶貴,呂來清.二維電泳和 iTRAQ 的實驗比較[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2008,24(5):538-542.

[4] Wu WW,Wang G,Baek SJ,et al.Comparative study of three proteomic quantitative methods,DIGE,cICAT,and iTRAQ,using 2D gel-or LC-MALDI TOF/TOF[J].JPR,2006,5(3):651-658.

[5] Overgaard AJ,Thingholm TE,Larsen MR,et al.Quantitative iTRAQ-based proteomic identification of candidate biomarkers for diabetic nephropathy in plasma of type 1 diabetic patients[J].Clin Prot,2010,6(4):105-114.

[6] 王玉,孫偉,左科,等.腎小球疾病患者尿液比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法的建立[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2014,23(2):140-145.

[7] Sui W,Tang D,Zou G,et al.Differential proteomic analysis of renal tissue in lupus nephritis using iTRAQ reagent technology[J].Rheumatol Int,2012,32(11):3537-3543.

[8] Choe LH,Aggarwal K,Franck Z,et al.A comparison of the consistency of proteome quantitation using two‐dimensional electrophoresis and shotgun isobaric tagging in Escherichia coli cells[J].Electrophoresis,2005,26(12):2437-2449.

[9] DeSouza L,Diehl G,Rodrigues M J,et al.Search for cancer markers from endometrial tissues using differentially labeled tags iTRAQ and cICAT with multidimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry[J].JPR,2005,4(2):377-386.

國家自然科學(xué)基金資助(81273911)

宋業(yè)旭，博士，研究實習(xí)員，Email:leaf615@sina.com

宋立群，教授，博士生導(dǎo)師，Email:qunli@sina.com

R692

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2015.05.033

2015-03-10)