王正陽，羅亞坤，呂世明，崔尚金*

（1.貴州大學(xué)動物科技學(xué)院藥理實驗室，貴州 貴陽 550025；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001）

豬細(xì)小病毒基因組特性的研究

王正陽1，2，羅亞坤2，呂世明1，崔尚金1，2*

（1.貴州大學(xué)動物科技學(xué)院藥理實驗室，貴州 貴陽 550025；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001）

豬細(xì)小病毒(PPV)屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬的成員。豬細(xì)小病毒病是由PPV引起的以胚胎和胎兒感染及死亡而母體本身無明顯癥狀的一種母豬繁殖障礙性傳染病。1967年，Carteright等對豬的不孕、流產(chǎn)、死產(chǎn)等進(jìn)行病原學(xué)研究時首次報道了本病，并從豬的流產(chǎn)胎兒中分離到PPV。目前，此病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是造成母豬繁殖障礙的主要病因之一。

探究豬細(xì)小病毒的基因組特性對臨床上防治該病毒的感染起到了至關(guān)重要的作用。最近30多年來，豬群中一直使用相同的滅活苗，但因PPV引起的母豬繁殖障礙仍時有報道，這突顯了PPV分離檢測的重要性，同時也提醒我們要考慮PPV的進(jìn)化與變異問題。目前，隨著國內(nèi)外對豬細(xì)小病毒基因特性研究的日益深入，盡管PPV病毒一直存在一些氨基酸序列替換，但人們普遍認(rèn)為PPV的核苷酸替代率低，接近于哺乳動物。然而，一些自主復(fù)制的細(xì)小病毒，包括犬細(xì)小病毒和人類的B19病毒， 它們每年每個位置的核苷酸替代率大約為1 × 10-4，這與RNA病毒很相似。此外，近年來的研究表明，一些新型細(xì)小病毒首次分離并鑒定，例如在豬體內(nèi)新分離出PPV2、PHoV(本文稱PPV3)和PPV4等，但這些病毒對豬的危害尚不清楚。

針對這些問題，本文對PPV的基因組和核苷酸的替代、分子進(jìn)化以及新型細(xì)小病毒的出現(xiàn)等進(jìn)行了綜述，以期為豬細(xì)小病毒的進(jìn)一步研究與防治提供參考。

1??PPV基因組

細(xì)小病毒的基因組是長約4 500～5 500 bp的單鏈DNA分子。病毒序列的2個末端有1個復(fù)雜的回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)（類似于“Y”或“T”形），約120至200個堿基。這些結(jié)構(gòu)可以作為病毒DNA復(fù)制過程中的引物，在保持病毒基因組完整性上可能起重要作用。在細(xì)小病毒基因組中有2個開放閱讀框（ORF）：一個編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，另一個編碼結(jié)構(gòu)蛋白。位于該基因組5'末端的ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1），也通過選擇性剪接來編碼非結(jié)構(gòu)蛋白2和3（NS2和NS3）。 NS1蛋白具有解旋酶和切割酶的功能，負(fù)責(zé)病毒的復(fù)制和加工。在3'末端，一個小的ORF和大的ORF通過拼接來編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白1（VP1）；病毒結(jié)構(gòu)蛋白2（VP2）是從相同的ORF轉(zhuǎn)錄得到的；病毒結(jié)構(gòu)蛋白3（VP3）是VP2的酶促裂解產(chǎn)物，其酶切位點位于VP2轉(zhuǎn)錄起始點下游70 nt處的區(qū)域，該區(qū)域甘氨酸含量豐富。此外，復(fù)制過程中的一個輔助蛋白（SAT）是由另一個位于基因組中間靠近VP2起始密碼子的小ORF編碼的。

2??PPV基因組的轉(zhuǎn)錄

PPV整個基因組的轉(zhuǎn)錄由2個啟動子指導(dǎo)：一個是P4，位于基因組的5’末端，啟動非結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄；另一個是P40，位于該基因組中間，啟動病毒結(jié)構(gòu)蛋白和SAT蛋白的轉(zhuǎn)錄。早期啟動子P4從基因組的225 nt處開始轉(zhuǎn)錄，晚期啟動子P40從 2 035 nt處開始轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生PT4和PT40這2種原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，兩者共同終止于4 833 nt處的poly(A)， PT4和PT40經(jīng)過4種不同的拼接方式，產(chǎn)生4種次級轉(zhuǎn)錄物R1（4.7 kb），R2(3.3 kb)，R3(3.9 kb)和R4 （2.9 kb）。而后翻譯成PPV的結(jié)構(gòu)蛋白（VP）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS）。

3??PPV基因組的編碼蛋白

3.1?結(jié)構(gòu)蛋白

結(jié)構(gòu)蛋白是PPV的主要免疫原性抗原。PPV基因組編碼了3種結(jié)構(gòu)蛋白：VP1、VP2和VP3，它們的分子質(zhì)量分別 是83 ku、64 ku和60 ku。VP1和VP2的許多氨基酸序列是重疊的。VP1的N端有一脯氨酸豐富區(qū)，在病毒從細(xì)胞外轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)起重要作用。VP2是構(gòu)成衣殼蛋白的主要成分，具有血凝活性，VP2基因編碼的多肽能自我裝配成類病毒粒子，是良好的抗原轉(zhuǎn)運載體，能誘導(dǎo)強的細(xì)胞免疫。VP3是VP2的翻譯后切割加工的產(chǎn)物，只在衣殼裝配和病毒基因組包裝后才出現(xiàn)。這3種病毒蛋白質(zhì)一起組裝形成二十面體的衣殼。不同的PPV毒株具有不同的致病性，其中結(jié)構(gòu)蛋白可能發(fā)揮著重要的作用。通過非致病性毒株NADL2和毒力株Kresse之間基因組的比較，它們非編碼區(qū)的基因組幾乎相同。其非結(jié)構(gòu)基因的氨基酸替換也都是相同的，8個能改變轉(zhuǎn)錄氨基酸的替換基因中，有6個位于結(jié)構(gòu)基因（VP1/VP2）中，VP2氨基酸與野株相比，有5個氨基酸（I-215-T，D-378-G，H-383-Q，S-436-P和R-565-K）改變一致，其中D-378-G，H-383-Q和S-436-P的改變，是導(dǎo)致PPV不同的組織嗜性的原因之一。

3.2??非結(jié)構(gòu)蛋白

PPV基因組編碼3種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2和NS3，分子質(zhì)量分別為75.5 ku、18.1 ku、12.4 ku。NS1具有解旋酶活性，可以改變PPV病毒末端的空間構(gòu)型，是病毒DNA的復(fù)制所必需的。PPV病毒的復(fù)制依賴其末端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從特異位點解開末端結(jié)構(gòu)區(qū)是起始和終止過程的先決條件，3’端序列引導(dǎo)DNA的合成，NS1蛋白具有內(nèi)切酶活性和共價結(jié)合5’端序列的特性，能共價結(jié)合復(fù)制型DNA的5’末端并具有特異部位的解鏈活性。

4??PPV的遺傳變異

研究表明一些細(xì)小病毒表現(xiàn)出較高替換率，接近于RNA病毒。在最近10到20年中PPV出現(xiàn)了較多的遺傳變異和新表型。在1994至2000年，Soares等人從巴西分離到毒株，并對VP2基因的部分片段進(jìn)行了分析，確定了至少18個不同的表型（至少1個氨基酸不同），并把它們劃分到了2個進(jìn)化群體。此外，在2001年和2002年，Zimmermann等人分離到毒株也檢測到6個不同的表型，在系統(tǒng)發(fā)育上可能被分成2個群。此后，中國和羅馬尼亞在對野毒株研究中也描述了幾個新的表型。

4.1?核苷酸的替代

一般認(rèn)為PPV的核苷酸替代率低，接近于哺乳動物，且PPV在進(jìn)化上亦比較保守，不同毒株雖然致病能力不同，但同源性卻很高，然而，近年來不斷出現(xiàn)的PPV新表型，而傳統(tǒng)的疫苗已經(jīng)不能有效預(yù)防某些PPV感染，這似乎表明PPV基因組出現(xiàn)了變異。為確認(rèn)PPV新的基因突變，André等人對從奧地利、巴西、德國和瑞士近期分離的毒株進(jìn)行了分析。對這些毒株的VP2基因的序列分析表明，在32個位點上發(fā)生了核苷酸替換，其中17個替換是同義的，15個替換是非同義的。在PPV全基因組的3889號核苷酸到4239號核苷酸之間被認(rèn)為是高度變異的區(qū)域，卻發(fā)現(xiàn)了3個同義替換和5個非同義替換，定義了2個守恒區(qū)（無核苷酸替換）一個在核苷酸3 507～3 718 bp之間，一個在 4 251～4 425 bp之間。對NS1基因的分析，發(fā)現(xiàn)44個位點有核苷酸替換。27個替換是同義的，17個替換是非同義的。確定了4個守恒區(qū)（無核苷酸替換），分別位于位點568～781 bp、847～1 022 bp、1 072～1 362 bp以及1 504～1 793 bp之間。在蛋白質(zhì)水平上，保守區(qū)位于結(jié)構(gòu)基因翻譯的83～225氨基酸和437～579氨基酸之間。同時發(fā)現(xiàn)了2個可變區(qū)：位于226～233和365～436號氨基酸之間，也發(fā)現(xiàn)了3個非結(jié)構(gòu)基因的保守區(qū)（無氨基酸替換），分別位于83～163，165～357和368～561號氨基酸之間。并且在該基因的末端562～658氨基酸之間，發(fā)現(xiàn)了一個具有更高變異性的區(qū)域。

4.2?PPV的進(jìn)化分析和選擇壓力

有關(guān)PPV新表型的報道表明，PPV新表型的衣殼表面的氨基酸發(fā)生了改變。這些氨基酸的替換可能引起病毒不同的致病性。研究表明大部分PPV疫苗株的抗體對于這些新表型的中和活性較低。因此，Zeeuw等人提出這樣一個假說：疫苗可能給PPV野毒株造成選擇壓力而導(dǎo)致“逃避突變體”。

然而，在野豬種群中的PPV基因型比家豬更多樣化，每年野豬的氨基酸替換率明顯高于研究中的家豬樣品的替換率。這與疫苗給PPV野毒株造成選擇壓力而導(dǎo)致其變異和遺傳多樣性增多這一結(jié)論似乎不相符，并且André等人的研究表明培養(yǎng)的同種病毒在有抗體壓力下比在沒有抗體壓力下，核苷酸和氨基酸的替換更少，尤其是在有同源抗體壓力的毒株中表現(xiàn)的特別明顯。在體外模型中研究中，發(fā)現(xiàn)有抗體存在的情況下遺傳多樣性更低。在強大的抗體選擇壓力下，PPV多數(shù)變異都是有害的，由此推測對PPV來說似乎抗體的中和選擇比適應(yīng)進(jìn)化更重要，而不是疫苗的使用導(dǎo)致PPV變異和進(jìn)化，因此推動細(xì)小病毒進(jìn)化的選擇力量仍然不確定。

對于PPV進(jìn)化樹和年代分析，André等人的研究表明，VP1全基因的貝葉斯最大進(jìn)化支生成的可信度樹顯示了2個不同的進(jìn)化支和2個簇，基于VP1部分基因的序列也確定了另外2個進(jìn)化支和另外1個簇。在NS基因進(jìn)化樹中，幾乎所有的序列都具有獨特的進(jìn)化樹，只有2個簇與VP1進(jìn)化樹是一致的。對NS和VP1數(shù)據(jù)集的年代分析表現(xiàn)出2種截然不同的時間周期。結(jié)構(gòu)基因中這2個數(shù)據(jù)集的主要分歧出現(xiàn)在過去30年，非結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)集分歧則在10至125年前的一段時間形成，主要集中在過去的30～60年。

選擇性壓力和進(jìn)化速率表現(xiàn)出相似的水平。崔尚金等人發(fā)現(xiàn)PPV大多數(shù)的變化是在高選擇壓力下觀察到的，研究發(fā)現(xiàn)不同的病毒或基因中的選擇壓力和替換率之間有明顯的相關(guān)性。在André等人的研究中，每個位點dN/dS替代的平均速率表明，NS1和VP1基因在進(jìn)行進(jìn)化選擇，根據(jù)測試的模型，證實壓力順序為部分VP1 ＞全VP1＞全NS1。而在PPV的進(jìn)化速率中，結(jié)構(gòu)基因的進(jìn)化速率亦是高于非結(jié)構(gòu)基因。

5??新型細(xì)小病毒的出現(xiàn)

2001年，Hijisaka等人從緬甸豬血清分離到的病毒H-1，鑒定為豬細(xì)小病毒之一，稱為豬細(xì)小病毒2型（PPV2）。此后該病毒在美國普遍流行，其中肺組織樣品中占20.7%，糞便占7.6%。此外，在胸液中也檢測出該病毒（1.6%）。

2008年，Su sanna等在香港屠宰的豬體內(nèi)分離到與人類細(xì)小病毒4同源性極高的一個病毒（本文稱為PPV3）。此后在幾個國家陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了這種病毒，Adlhoch C等人在德國獵捕的野豬中對該病毒的DNA的檢出率很高（37.7%）。

2010年，在混合感染豬圓環(huán)病毒2型病豬的肺臟中鑒定分離了另一個細(xì)小病毒，并命名為豬細(xì)小病毒4（PPV4）。此后在中國的患病動物中也發(fā)現(xiàn)了該病毒。此外，斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的患豬淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)了豬博卡病毒。但與觀察到的臨床癥狀不太相符，也有可能存在其他的新型細(xì)小病毒感染。

目前，PPV2、PPV3、PPV4在國內(nèi)還鮮有報道，尚不清楚其對豬群的危害。

6??結(jié)語

目前，豬細(xì)小病毒感染在世界各地的豬群中普遍存在，是造成母豬繁殖障礙的主要原因之一，沒有治療PPV的特效方法，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。病毒的廣泛分布使得該病毒難以控制?？刂芇PV最有效的措施就是對豬群進(jìn)行合理的疫苗免疫。

此外，近年來發(fā)現(xiàn)PPV在不斷的演變，推動PPV演變的力量仍不清楚，需要科學(xué)家們不懈努力去探索。PPV，PPV2和PPV3的廣泛流行及遺傳的多樣性也突顯了對細(xì)小病毒進(jìn)行持續(xù)檢測是必要的。 (參考文獻(xiàn)略)

2014-08-12）

王正陽（1989-）男，山東即墨人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)和豬細(xì)小病毒受體研究。

*通信作者：崔尚金，E-mail：cuishangjin@126.com