徐方正，姜?jiǎng)灼?，劉桂瓊，謝光躍，張騰龍，王建國，王潤申

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，湖北武漢 430070;2.湖北多羔育種生物科技有限公司，湖北武漢 430070; 3.通山烏骨山羊育種有限公司，湖北通山 437600)

烏骨山羊肌肉組織中黑色素來源分析

徐方正1，姜?jiǎng)灼?*，劉桂瓊1，謝光躍1，張騰龍1，王建國2，王潤申3

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，湖北武漢 430070;2.湖北多羔育種生物科技有限公司，湖北武漢 430070; 3.通山烏骨山羊育種有限公司，湖北通山 437600)

烏骨山羊肌肉組織中黑色素的的分布、含量和來源是探明烏質(zhì)性狀形成機(jī)理的關(guān)鍵。本研究以普通山羊?yàn)閷?duì)照，用多巴組織化學(xué)染色法觀察背最長肌組織切片中黑色顆粒分布;用酶解法測(cè)定烏骨山羊肌肉中的黑色素含量;用紫外可見光分光光度法測(cè)定烏骨山羊血清中的褐黑素、堿溶性黑色素和血漿顏色。結(jié)果表明:烏骨山羊肌肉組織中存在黑色素顆粒，而普通山羊肌肉組織中沒有黑色素顆粒;烏骨山羊肌肉內(nèi)黑色素含量為0.416%，其含量是普通山羊的7.6倍(＜0.01);烏骨山羊血清中的褐黑素、堿溶性黑色素的含量與普通山羊的并無顯著差異(＞0.05);在肌肉組織中沒有發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞分布。由此推測(cè)，烏骨山羊肌肉組織中黑色素是黑色被毛毛囊外根鞘黑素細(xì)胞分泌，經(jīng)血液運(yùn)輸?shù)郊∪饨M織中沉積，緩慢形成烏骨山羊肌肉的“烏色”性狀。

肌肉組織;黑素細(xì)胞;黑色素;烏骨山羊

烏骨山羊組織器官中有大量黑色素沉積,呈現(xiàn)出“烏骨烏肉”的種質(zhì)特征。通常情況下,黑色素主要由黑素細(xì)胞合成和分泌。黑素細(xì)胞主要分布在皮膚和毛囊中,視網(wǎng)膜上皮、虹膜、眼葡萄膜、軟腦膜和內(nèi)耳中也有少量分布［1-2］。最近在睪丸中也發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞分布［3］。黑素細(xì)胞的研究熱點(diǎn)主要集中在表皮基底層和毛囊組織中。表皮基底層的黑素細(xì)胞合成的黑色素主要用于形成膚色,具有光保護(hù)作用,使機(jī)體免受紫外線傷害［4］;毛囊黑素細(xì)胞合成的黑色素主要用于形成毛色,具有廣泛的生態(tài)適應(yīng)性［5］。謝光躍等［6］研究發(fā)現(xiàn),黑素細(xì)胞在烏骨山羊表皮基底層和毛囊中大量分布,并且黑色被毛的毛囊外根鞘部位的黑素細(xì)胞呈現(xiàn)活化狀態(tài),即毛囊外根鞘中的黑素細(xì)胞大量活化并產(chǎn)生黑色素,是黑色皮膚和黑毛的主要來源。但是烏骨山羊肌肉中的黑色素是否來自毛囊中黑素細(xì)胞還不得而知。本實(shí)驗(yàn)主要探索烏骨山羊肌肉組織中黑色素的來源,以期為解釋烏骨山羊肌肉組織中黑色素沉積機(jī)理提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 肉樣和血樣采集 在通山烏羊育種有限公司羊場(chǎng)隨機(jī)選取烏骨山羊3只、普通山羊1只,屠宰后分別采集各個(gè)體的背最長肌,置于液氮中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,保存于-80℃冰箱備用。

62個(gè)烏骨山羊血液樣品和62個(gè)普通山羊血液樣品分別采于通山烏羊育種有限公司羊場(chǎng)和重慶市畜牧科學(xué)院酉州烏羊保種場(chǎng)。用一次性無菌注射器采集山羊前腔靜脈血液5 mL,分離血清置-20℃低溫冰箱備用。

1.2 主要試劑 L-左旋多巴染色染料、核固紅染料購于上海源葉生物科技有限公司;木瓜蛋白酶(2 000 U)和胰蛋白酶購于武漢市普博欣生物科技有限公司,胰液素購于武漢百賽實(shí)驗(yàn)試劑;Soluene-350購置于美國PerkinElmer。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 肌肉組織切片多巴組化染色 采用多巴組織化學(xué)染色法對(duì)烏骨山羊和普通山羊的背最長肌切片進(jìn)行染色分析觀察黑色素顆粒的分布,具體方法參考文獻(xiàn)［6］。

1.3.2 山羊肌肉組織中黑色素酶解法提取 采用酶解法從4個(gè)山羊肌肉樣品中提取黑色素,具體方法參考文獻(xiàn)［7］。根據(jù)羊肉特點(diǎn)作了改進(jìn),對(duì)每個(gè)肉樣做3次重復(fù)。用木瓜蛋白酶、胰液素和胰蛋白酶對(duì)肉樣進(jìn)行處理,用Triton X-100、氯仿、石油醚、甲醇水溶液(水∶甲醇1∶1 v/v)和蒸餾水反復(fù)進(jìn)行洗滌,得到黑色素顆粒。

1.3.3 山羊血清中黑色素指標(biāo)的測(cè)定 分別測(cè)定62頭烏骨山羊和62頭普通山羊的124個(gè)血樣的褐黑素、堿溶性黑色素和血漿顏色。具體方法參考文獻(xiàn)［8］。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 將測(cè)得的山羊肌肉組織中黑色素含量數(shù)據(jù)和血清中黑色素含量的指標(biāo)(褐黑素、堿溶性黑色素和血漿顏色)采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件,用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 烏骨山羊肌肉與組織切片 由圖1可以看出,兩者之間具有明顯的顏色差異。烏骨山羊肌肉顏色呈烏黑色(圖1-A),而普通山羊肌肉為鮮紅色(圖1-B)。

從多巴組織化學(xué)染色法得到的烏骨山羊肌肉組織切片中存在著大量黑色素顆粒,而且這些黑色素顆粒分布不規(guī)則(圖1-C);但是普通山羊肌肉組織切片未見黑色素顆粒(圖1-D)。

2.2 肌肉內(nèi)黑色素含量 利用酶解法從山羊肌肉中提取黑色素的結(jié)果顯示,烏骨山羊肌肉內(nèi)黑色素含量為0.416%,普通山羊的黑色素含量為0.055%。烏骨山羊肌肉中的黑色素含量是普通山羊的7.6倍,兩者差異極顯著(＜0.01)。

2.3 血清中黑色素含量 由表1可以看出,烏骨山羊和普通山羊間血清中都有褐黑色素和堿溶性黑色素,但是褐黑色素、堿溶性黑色素以及血漿顏色在二者間均無顯著差異(＞0.05)。

3 討 論

3.1 肌肉組織中黑色素含量的分析 提取肌肉組織中黑色素的方法主要有酸解法和蛋白酶解法。相比于酸解法,酶解法提取得到的黑色素純度更高,黑色素顆粒結(jié)構(gòu)也不會(huì)被破壞,是現(xiàn)在主要的黑色素提取方法。酶解法測(cè)得烏骨山羊肌肉中的黑色素含量是普通山羊肉的7.6倍。這與之前文獻(xiàn)中報(bào)道烏骨雞和烏骨綿羊的肌肉組織中黑色素含量較高的結(jié)論一致［9-10］。可見,烏骨山羊“烏肉”的特征是由肌肉組織中含有大量黑色素而形成的烏質(zhì)性狀。

3.2 烏骨山羊肌肉組織中黑色素來源 在動(dòng)物體內(nèi),黑素細(xì)胞主要分布于表皮和毛囊中。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)烏骨山羊組織器官中的黑素細(xì)胞進(jìn)行染色定位發(fā)現(xiàn),烏骨山羊黑素細(xì)胞主要也是分布在表皮基底層、毛球部和毛球外根鞘,其他組織中未見黑素細(xì)胞的分布［11］,但是烏骨山羊黑色被毛的毛囊外根鞘部位的黑色素細(xì)胞呈活化狀態(tài),并且能夠合成黑色素顆粒［6］;然而其他動(dòng)物的毛囊外根鞘的黑色素細(xì)胞不分泌黑色素［12］。黑色素的排泄分為2個(gè)途徑∶一種是大部分黑素細(xì)胞分泌黑色素顆粒轉(zhuǎn)移到角質(zhì)細(xì)胞中,隨角質(zhì)細(xì)胞的周期性脫落而發(fā)生運(yùn)輸［13］;二是部分黑素細(xì)胞將黑色素顆粒運(yùn)輸?shù)降秸嫫?經(jīng)由輸色素細(xì)胞吞噬,參與到血液循環(huán)［14］。由于烏骨山羊黑色被毛毛囊外根鞘部分黑素細(xì)胞的特殊性,推測(cè)烏骨山羊肌肉組織中的黑色素由黑色被毛毛囊外根鞘黑素細(xì)胞分泌然后通過血液運(yùn)輸?shù)郊∪饨M織中。本研究發(fā)現(xiàn),烏骨山羊和普通山羊血液血清中都含有黑色素,兩者之間并無顯著差異。這就存在這樣的可能,黑色素由血液運(yùn)輸?shù)缴窖蚣∪饨M織中,烏骨山羊黑色被毛毛囊外根鞘黑素細(xì)胞分泌的黑色素顆粒具有特殊性質(zhì),烏骨山羊?qū)谏氐慕到馑俣缺绕胀ㄉ窖虻穆?或者烏骨山羊體內(nèi)缺乏降解此類黑色素相關(guān)的酶,從而使黑色素在烏骨山羊體內(nèi)沉積更多,當(dāng)累積到一定時(shí)間和一定濃度后,則會(huì)出現(xiàn)烏骨山羊“烏肉”的性狀。這可能是由于烏骨山羊降解黑色素的速度慢于普通山羊?qū)е铝撕谏卦跒豕巧窖蚣∪饨M織內(nèi)沉積,這也可以由本研究在烏骨山羊群體中觀察到的年齡與烏質(zhì)現(xiàn)象相關(guān)得到印證,即年齡越大的烏骨山羊,烏質(zhì)性狀越明顯,烏骨綿羊群體內(nèi)也存在這種現(xiàn)象,即隨著年齡的增加,組織器官中的黑色素含量也隨之增加,與從外貌觀察的結(jié)果基本相同［15］。即烏骨山羊體內(nèi)黑色素的沉積量是隨著年齡的增加而逐漸增加的,具有明顯的累積效應(yīng)。為此,以后測(cè)定烏骨山羊與普通山羊黑色素降解有關(guān)酶的活性或基因效應(yīng),將有助于闡明烏骨山羊?yàn)踬|(zhì)性狀形成的分子機(jī)理。

4 結(jié) 論

烏骨山羊肌肉組織中含有大量黑色素顆粒,這些黑色素顆?？赡苁怯珊谏幻彝飧屎谏丶?xì)胞分泌,經(jīng)由血液運(yùn)輸?shù)綖豕巧窖蚣∪饨M織中緩慢沉積,從而形成了烏骨山羊“烏肉”的特性。

致謝:感謝華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳與繁殖實(shí)驗(yàn)室提供的實(shí)驗(yàn)條件以及通山烏羊育種公司和重慶市畜牧科學(xué)院提供的實(shí)驗(yàn)材料。

［1］ Lin J Y,Fisher D E.Melanocyte biology and skin pigmentation［J］.Nature,2007,445(7130):843-850.

［2］Aoki H,Yamada Y,Hara A,et al.Two distinct types of mouse melanocyte:differential signaling requirement for the maintenance of non-cutaneous and dermal versus epidermal melanocytes［J］. Development,2009,136(15):2511-2521.

［3］ Zieri R,Taboga S R,De Oliveira C.Melanocytes in the testes of Eupemphixnattereri(Anura,Leiuperidae):histological,stereological, and ultrastructural aspects［J］.Anat Rec,2007,290(7):795-800.

［4］ Nishimura E K.Melanocyte stem cells:a melanocyte reservoir in hair follicles for hair and skin pigmentation［J］.Pigm Cell Mel Res, 2011,24(3):401-410.

［5］ Nishimura E K,Suzuki M,Igras V,et al.Key roles for transforming growth factor β in melanocyte stem cell maintenance［J］.Cell Stem Cell,2010,6(2):130-140.

［6］ 謝光躍,劉桂瓊,姜?jiǎng)灼?等.烏骨山羊皮膚黑素細(xì)胞的分布及特征［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,33(2):83-88.

［7］ Novellino L,Napolitano A,Prota G.Isolation and characterization of mammalian eumelanins fromhair and irides［J］.BBA Gen Subjects,2000,1475(3):295-306.

［8］ Ozeki H,Ito S,Wakamatsu K,et al.Chemical characterization of hair melanins in various coat-color mutants of mice［J］.J Invest Dermatol,1995,105(3):361-366.

［9］ Tu Y,Sun Y,Tian Y,et al.Physicochemical characterisation and antioxidant activity of melanin from the muscles of Taihe Black-bone silky fowl(Gallus gallus domesticus Brisson)［J］. Food Chem,2009,114(4):1345-1350.

［10］楊舒黎,舒文,毛華明,等.云南地區(qū)烏骨綿羊黑色素的初步研究［J］.畜牧與獸醫(yī),2006,38(3):17-20.

［11］謝光躍.黑素細(xì)胞分布規(guī)律及基因差異表達(dá)［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

［12］Tobin D J,Bystryn J C.Different populations of melanocytes are present in hair follicles and epidermis［J］.Pigm Cell Res,1996, 9(6):304-310.

［13］Haass N K,Smalley K S M,Li L,et al.Adhesion,migration and communication in melanocytes and melanoma［J］.Pigm Cell Res,2005,18(3):150-159.

［14］張琳西,郭樹忠.皮膚色素代謝性疾病 ［J］.中國美容醫(yī)學(xué), 2000,(4):253-255.

［15］毛華明,鄧衛(wèi)東,孫守榮,等.云南烏骨綿羊的發(fā)現(xiàn)及其特征性狀的研究［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,20(1): 89-93.

The Origin of Melanin in Muscular Tissue of Black-boned Goat

XU Fang-zheng1,JIANG Xun-ping1*,LIU Gui-qiong1,XIE Guang-yue1,ZHANG Teng-long,WANG Jian-guo2, WANG Run-shen3
(1.Institute of Animal Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Hubei Wuhan 430070,China; 2.Hubei Multi-lambs’Breeding Biological Technology Company,Hubei Wuhan 430070,China;3.Tongshan Blackboned Goat Breeding Company,Hubei Tongshan 437600,China)

It is a key point to know that the distribution and content of melanin in the black-boned goat’s muscle,it is also important to know where the melanin come from to understand why the black-boned goat has the black meat. Comparing with ordinary goat,making the longissimus doris section of black-boned goat and ordinary goat by DOPA straining;Extracting the melanin from the muscle of black-boned goat and ordinary goat by enzyme and calculating the melanin content;Measuring the melanin index (pheomelanin,alkali-soluble melanin and plasma color)by ultraviolet visible spectrophotometry in the serum.The results showed that there was a large number of melaningranules in the muscle of black-boned goat and none in ordinary goat’s muscle,the content of the melanin in blackboned goat was 0.416%,it was 7.6 times of that in the ordinary goat(P＜0.01);The content of the melanin index in goat’s serum was no significant difference between black-boned goat and ordinary goat(P＞0.05);Meanwhile there was no melanocyte in the black-boned goat’s muscle,so the melanin might be secreted by the melanocytes in the outer root sheath of the black hair follicles in black-boned goat and transported by blood,these melanin slowly deposited in the muscle,and then the color of black-boned goat’s muscle became black.

muscle tissue;melanocyte;melanin;black-boned goat

S827.2

A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:0258-7033(2015)11-0010-03

2014-11-17;

2014-12-29

國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS39-1)

徐方正(1990-),男,碩士研究生,主要從事烏骨山羊?yàn)踬|(zhì)性狀形成機(jī)理研究,E-mail:xnfangzhengsophia@qq.com

*通訊作者:姜?jiǎng)灼?男,教授,博士生導(dǎo)師,E-mail:xpjiang@mail. hzan.edn.cn