付婷婷 尹勝男 朱靜芬 程 亮 李勇剛

2 蘇州大學功能納米與軟物質(zhì)研究院

乳腺癌是臨床上常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居大城市女性腫瘤的第一位，已成為對婦女健康威脅最大的疾病[1]。高表達HER2受體的乳腺癌惡性程度高、淋巴結轉移早、術后易復發(fā)、預后極差[2]。因此，在體檢測乳腺癌HER2受體表達水平，對于手術方案的制訂、術后復發(fā)與殘留灶的早期發(fā)現(xiàn)、預后評估均具有十分重要的臨床意義。Trastuzuma是一種人源性IgG1單克隆抗體，能與HER2受體的膜外段高效、特異性結合，其親合常數(shù)（Kd）為0.1nM，已應用于乳腺癌的臨床靶向治療[3-5]。本課題采用稀土上轉換光學材料氟化鈉釓（UCNP）納米晶體標記Trastuzumab，構建基于UCL/MRI多模態(tài)顯像的靶向納米顆粒UCNPPEG-Trastuzumab，體外行細胞結合試驗及UCL/MRI多模態(tài)顯像,檢測其結合效率。采用上轉換光學成像、MRI T1加權成像（T1WI），探討基于HER2靶點的多模態(tài)顯像用于乳腺癌靶向診斷的可行性及價值。

方 法

1.材料

1.1 主要試劑：本實驗所用稀土元素(Gd、Yb、Er)均為上?；瘜W工業(yè)有限公司產(chǎn)品，有機溶劑(OA、ODE)、MTT及有機高分子（PEG）為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，胎牛血清和DAPI為美國Invitrogen產(chǎn)品，細胞培養(yǎng)基購買于Thermo Scientific公司，SKBR3細胞由上海中科院細胞庫提供。

1.2 主要儀器：酶標儀、共聚焦顯微鏡，3.0T MRI等。

2.UCNP的合成、表征與修飾

通過熱分解法將稀土氧化物與三氟乙酸反應制得的三氟乙酸鹽作為先驅體，加入到高沸點有機溶劑（OA、ODE體系)中，在惰性氣體氮氣保護下升溫到320℃左右，使三氟乙酸鹽熱分解生成稀土氟化物NaGdF4（UCNP）。

通過透射電子顯微鏡(TEM)的表征，可以觀察納米微粒的形貌和粒子大小，徑粒分布情。用電感耦合等離子體質(zhì)譜技術（ICP）測得UCNP的濃度。

合成的UCNP材料表面為疏水基，通過聚合物包覆法用已合成的高分子C18PMH-PEG在氯仿中修飾UCNP，修飾后，UCNP-C18PMH-PEG（簡稱UCNPPEG）在水相中溶解度好。

3.UCNP-PEG與抗體連接，即UCNP-PEGTrastuzumab的制備

在pH=7.2～7.4的條件下，以EDC作為催化劑，用Sulfo-SMCC活化UCNP-PEG；用trant’s試劑、Herceptin抗體及EDTA溶液在pH=8的條件下完成抗體的巰基化偶聯(lián)；將巰基化的抗體與活化的UCNP-PEG混合，反應24h，合成UCNP-PEG-Trastuzumab顆粒。

4.細胞毒性實驗（MTT）

UCNP-PEG取9個濃度梯度，分別是400、200、100、50、25、12.5、6.3、3.2、1.6μg/ml，孵育24h后，加入MTT（5mg/ml），4h后除去培養(yǎng)基和材料混合物，加入DMSO，選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。

5.SKBR3細胞細胞標記后體外UCL/MRI成像

5.1 共聚焦顯微鏡成像（Confocal）：以1×105/ml的細胞濃度進行細胞接種并培養(yǎng)過夜，20μg/ml濃度的UCNP-PEG-Trastuzumab、UCNP-PEG與SKBR3細胞共孵育30min后，反復PBS沖洗未結合材料，加入4%甲醛固定細胞，DAPI染細胞核，反復PBS沖洗染液，進行共聚焦顯微鏡成像，激發(fā)光波長為980nm。

5.2 體外MRI成像：分別設置water（水）、untreated（純SKBR3細胞）、UCNP（UCNP-PEG孵育細胞）及UCNP-Trastuzumab（UCNP-PEGTrastuzumab孵育細胞）四組，純細胞作為空白組，加入20μg/ml濃度的非靶向探針UCNP-PEG的為對照組，加入20μg/ml濃度的UCNP-PEG-Trastuzumab的為實驗組，材料與細胞孵育30min，均用PBS洗去未結合材料，然后四組樣品均置于2ml EP管中，進行MRI成像并測量信號強度。

掃描條件：采用腕關節(jié)線圈，選擇快速自旋回波序列進行T1WI掃描，掃描參數(shù)：TR 440ms，TE 149ms，視野60mm，層厚2mm，無間距掃描，矩陣256×192，采集次數(shù)4，翻轉角90°。

結 果

1.UCNP的形貌與光學特性

透射電鏡（TEM）顯示其形態(tài)為球形，粒徑約為60nm左右（圖1）。高分子C18PMH-PEG修飾的UCNP在去水中具有很好的分散性，通過ICP測試濃度為1mg/ml，UCNP的上轉換發(fā)射光譜，可以發(fā)現(xiàn)其發(fā)射光譜范圍為500～700nm，峰值為540nm（圖2）。溶于水的UCNP-PEG在980nm激發(fā)光下的樣品，可見發(fā)出很強的綠色熒光（圖3）。

2.UCNP-PEG對SKBR3細胞的毒性分析

UCNP-PEG與細胞共孵育24h后，其對細胞的毒性，結果顯示實驗濃度的UCNP-PEG對SKBR3細胞沒有明顯毒性（圖4）。

3.SKBR3細胞細胞標記后體外UCL/MRI成像

結果

在Confocal成像中，實驗組UCNP-PEGTrastuzumab處理的SKBR3細胞膜表面可見均勻分布的綠色熒光，細胞內(nèi)無熒光，而對照組UCNP-PEG處理的SKBR3細胞則無此顯像（圖5），由此證明靶向探針UCNP-PEG-Trastuzumab可以與膜受體HER2特異性結合。

圖1 UCNP投射電鏡圖像，UCNP為大小均勻的類圓形球狀結構，大小為60nm。圖2 UCNP的上轉換發(fā)射光譜，其發(fā)射光譜范圍為500～700nm，峰值為540nm。

圖3 UCNP-PEG-Trastuzumab在可見光與980nm激發(fā)光下的圖片。A.可見光下為透澄清的液體。B.980nm激發(fā)光下發(fā)出較亮的綠光。

圖4 細胞毒性實驗（MTT），在對照組不加材料，九組不同材料濃度下的細胞毒性，細胞存活率均在85%以上。圖5 Confocal圖像，實驗組UCNP-PEG-Trastuzumab處理細胞周圍可見均勻分布的環(huán)形綠色熒光，細胞內(nèi)無熒光，而對照組UCNP處理細胞內(nèi)外均無UCNP熒光。

四組樣品經(jīng)MRI 掃描示靶向探針UCNP-PEGTrastuzumab處理的HER2表達陽性的SKBR3細胞信號強度為510，呈明顯短T1高信號；非靶向探針UCNPPEG處理的對照組細胞信號強度為360，呈T1稍高信號；空白組MR掃描信號強度為329，呈T1等信號；水信號強度為206，呈T1低信號（圖6）。

圖6 MRI T1加權像，water（水）、untreated（純Sk-br-3細胞）、UCNP（UCNP-PEG孵育細胞）及UCNP-Trastuzumab（UCNP-PEGTrastuzumab孵育細胞）四組在MRI T1WI上信號強度分別為206、329、360、510，呈由暗到亮的梯度變化。

討 論

乳腺癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，并已成為對婦女健康威脅最大的疾病，根據(jù)2010年中國人口協(xié)會發(fā)布的《中國乳腺疾病調(diào)查報告》顯示：我國城市地區(qū)乳腺癌的病死率增長了38.91%，發(fā)病率位居大城市女性腫瘤的第一位[1]。各型乳腺癌中，HER2受體高表達的乳腺癌惡性程度高、淋巴結轉移早、術后易復發(fā)、預后極差[2]，本實驗探索性的研究了對HER2受體高表達的乳腺癌細胞進行靶向成像的新技術，其對于該型乳腺癌手術方案的制訂、術后復發(fā)與殘留灶的早期發(fā)現(xiàn)、預后評估均具有十分重要的臨床意義。

光學成像技術具有非電離、非接觸、高靈敏度、高通量和低成本的優(yōu)點，而且可以提供細胞或分子水平的信息，幾乎是單分子敏感；但由于生物組織對可見光具有較強吸收和散射作用，導致可見光在生物組織中的穿透深度較淺和圖像信噪比較差，并且在體內(nèi)實驗中，不能很好的顯示組織解剖和生理細節(jié)。MRI在體內(nèi)實驗時，具有較好的空間分辨率、軟組織分辨率和無輻射特點，可以提供充分的解剖信息，對乳腺癌的檢查有獨特的優(yōu)勢，由于缺乏分子水平成像能力和較低敏感性，對早期乳腺癌與轉移病灶診斷困難[6]。

稀土上轉換納米粒子（UCNP），作為一種新型的光學材料，其具有獨特的多光子激發(fā)特征，能在近紅外光（980nm）的激發(fā)下發(fā)射出短波長的可見光（綠光），實現(xiàn)光子能量的上轉換，因而具有更好的光學穩(wěn)定性和近紅外激發(fā)光的強組織穿透性[7-8]。UCNP中各稀土元素比例分別為Gd78%、Yb20%、Er2%，而UCNP中含有的稀土元素Gd對T1弛豫時間影響較大，可通過縮短氫質(zhì)子的弛豫時間而影響組織的T1弛豫時間，所以作為MR成像的T1WI造影劑，UCNP成功的將光學成像與MRI相結合，可結合不同成像方法的優(yōu)點，克服單種成像方式的不足，形成兼顧空間分辨率、成像深度、軟組織分辨率、敏感性、細胞水平成像能力的探針技術，UCNP可用于多模態(tài)顯像的研究[9]。乳腺癌分子靶向治療藥物Trastuzumab（曲妥珠單抗）能與HER2受體的膜外段高效、特異性結合[10-12]，最后用高分子C18PMHPEG修飾UCNP，使其具有水溶性，并提供氨基，為連接Trastuzumab提供橋梁，合成的UCNP-PEGTrastuzumab可以實現(xiàn)對HER2高表達人乳腺癌SKBR3細胞靶向標記與成像。

根據(jù)MTT實驗以及UCNP成像特點，選擇濃度為20μg/ml的UCNP-C18PEG-Trastuzumab進行實驗，而Confocal成像和MRI成像均說明UCNP-PEGTrastuzumab對SKBR3細胞有特異性吸附，并說明可以對SKBR3細胞靶向成像。對比20μg/ml的UCNPPEG-Trastuzumab和UCNP-PEG對SKBR3細胞的靶向結合能力，經(jīng)非靶向探針UCNP-PEG處理過的細胞T1WI呈稍高信號，可能是由于UCNP-PEG沉積在細胞間隙未能被PBS 徹底洗滌所致。

總之，UCNP-PEG融合了光學和核磁共振成像技術，再與Trastuzumab連接后，可以對HER2受體高表達的乳腺癌細胞行細胞靶向成像[13-15]。本實驗強調(diào)了UCNP-PEG-Trastuzumab作為一種乳腺癌細胞成像特異性多功能探針的潛力，UCNP-PEG對SKBR3細胞毒性微小，由于在UCNP發(fā)射光譜范圍內(nèi)時，人體自發(fā)光背景干擾較小，用UCNP-PEG-Trastuzumab標記SKBR3細胞具有較高的敏感性，為進一步的活體實驗提供基礎，通過光學和MRI靶向成像為乳腺癌個體化治療提供影像學依據(jù)。

此外，作為探索性研究，本實驗未探討探針濃度、成像時間及腫瘤HER2表達水平與光學、MRI信號之間相關性，需在后續(xù)實驗中進一步深入研究課題。本課題組自行制備的多功能靶向探針具有良好的光學和磁學特性，體外細胞成像顯示出針對乳腺癌HER2靶向成像效果，為下一步進行體內(nèi)成像研究奠定了基礎。

[1]徐雅莉,孫 強.乳腺癌高危因素.腫瘤防治研究,2010,37:1201-1205.

[2]Fehm T,Muller V,Aktas B,et al.HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer:a prospective,multicenter trial.Breast Cancer Res Treat,2010,124:403-412.

[3]Capala J,Bouchelouche K.Molecular imaging of HER2-positive breast cancer:a step toward an individualized ’imageand treat’strategy.Curr Opin Oncol,2010,22:559-566.

[4]Milenic DE,Wong KJ,Baidoo KE,et al.Targeting HER2:a report on the in vitro and in vivo pre-clinical data supporting trastuzumab as a radioimmunoconjugate for clinical trials.MAbs.2010,2:550-564.

[5]Cameron DA,Stein S.Drug insight:intracellular inhibitors of HER2--clinical development of lapatinib in breast cancer.Nat Clin Pract Oncol,2008,5:512-520.

[6]汪登斌,譚 令,江 浩,等.乳腺癌MRI研究.中國醫(yī)學計算機成像雜志,2002,8:23-27.

[7]Cheng L,Yang K,Zhang S,et al.Multicolor in vivo Lymphatic Imaging Using PEGylated Up-conversion Nanoparticles.Nano Res,2010,3:722-732.

[8]Cheng L,Yang K,Zhang S,et al.Multicolor in vivo Imaging of Upconversion Nanoparticles with Emissions Tuned by Luminescence Resonance Energy Transfer.J.Phys.Chem.C,2011,115:2686-2692.

[9]Dev K.Chatterjee,Abdul J.Rufaihah,and Yong Zhang,Upconversion Fluorescence Imaging of Cells and Small Animals Using Lanthanide Doped Nanocrystals’,Bioma terials,2008,29:937-43.

[10]Tai W,Mahato R,Cheng K.The role of HER2 in cancer therapy and targeted drug delivery.J Control Release,2010,146:264-275.

[11]Nahta R,Yu D,Hung MC,et al.Mechanisms of disease:understanding resistance to HER2-targeted therapy in humanbreast cancer.Nat Clin Pract Oncol,2006,3:269-280.

[12]Shadidi M,Sioud M.Identification of novel carrier peptides forthe specific delivery of therapeutics into cancer cells.FASEB J,2003,17:256-258.

[13]Zhang W,Chen Y,Guo DJ,et al.The synthesis of aD-glucosamine contrast agent,Gd-DTPA-DG,and its application in cancer molecular imaging with MRI.Eur J Radiol,2011,79:369-374.

[14]Crich SG,Lanzardo S,Alberti D,et al.Magnetic resonance imaging detection of tumor cells by targeting low-density lipoprotein receptors with Gd-loaded low-density lipoprotein particles.Neoplasia,2007,9:1046-1056.

[15]Meng Q,Li Z.Molecular imaging probes for diagnosis and therapy evaluation of breast cancer.Int J Biomed Imaging,2013,2013:230487.