項保利 李琳琳 曹 亮 陳麗萍

1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院急診科，河北張家口 075000

惡性腫瘤已成為當(dāng)今危害人類生命的頭號殺手， 全世界每年惡性腫瘤的致死人數(shù)超過1000 萬人，死亡率列居疾病之首[1]。在各種類型的惡性腫瘤中，肺癌對人類的危害尤為顯著，據(jù)統(tǒng)計近20 年肺癌的死亡率已位居腫瘤首位，對人類的健康和生存構(gòu)成重大威脅[2]。隨著研究的逐漸深入，越來越多的證據(jù)證明多種惡性腫瘤皆由一種具有自我更新能力的細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，這種細(xì)胞被稱為“腫瘤干細(xì)胞”，這給惡性腫瘤的治療提供了新的方向，人們期望以腫瘤干細(xì)胞為靶向治療方法能夠有效根除腫瘤，改善患者預(yù)后。Sox2、Oct4 是其中具有代表性的胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，兩者的突變和異常表達(dá)與許多體內(nèi)腫瘤有關(guān)[3]。 Oct4 是轉(zhuǎn)錄因子POU 家族中具有代表性的胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子。該轉(zhuǎn)錄因子在胚胎干細(xì)胞、成人組織的祖細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞、原發(fā)腫瘤、胚胎和生殖腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。研究人員實驗發(fā)現(xiàn)，該基因只表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中，在正常的體細(xì)胞中則表達(dá)缺失，很自然地傾向于Oct4在腫瘤形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 Sox2 是性別決定區(qū)因子，是遺傳特性及保持膠質(zhì)瘤祖細(xì)胞增殖的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，存在于各類腫瘤中。 這兩個基因共同參與基因調(diào)控網(wǎng)路，在胚胎形成和胚胎干細(xì)胞的多分化潛能及自我更新能力中發(fā)揮著重要作用。這些基因特異性的表達(dá)不在體細(xì)胞中，而在于人類生命周期的階段中，因此對癌癥治療的潛力巨大。 近年來國內(nèi)外研究對象多為細(xì)胞系，且研究方向主要為調(diào)節(jié)基因表達(dá)能力方面，對實體瘤方面的研究較少。 近年來各類研究成果指出，這兩種因子在部分典型的腫瘤細(xì)胞系中有一定表達(dá)，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 但關(guān)于在肺癌組織中是否有兩種因子的表達(dá)及是否參與疾病進(jìn)展與預(yù)后的各類問題目前尚無詳細(xì)報道。本研究采用免疫組化生物學(xué)實驗技術(shù)，檢測肺癌組織中Sox2、Oct4的表達(dá)情況，并比較在各類型癌組織中兩種因子表達(dá)水平的差異，分析其與肺癌的病理類型、臨床分期、分化程度及其發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010 年1 月～2013 年12 月于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的肺癌患者60 例，所有患者均經(jīng)病理檢查確診。 其中男38 例，女22 例，年齡34～72 歲，平均（53.9±19.2）歲。依據(jù)2004 年WHO 制訂的肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分型及分期，60 例患者中鱗癌30 例、腺癌20 例、小細(xì)胞癌5 例和大細(xì)胞癌5 例；TNM 分期：Ⅰ期19 例，Ⅱ期15 例，Ⅲ期17 例，Ⅳ期9 例。所有患者均為首次發(fā)病且術(shù)前未進(jìn)行化療、放療及免疫治療。 另取我院同期經(jīng)肺部手術(shù)切除并蠟塊存檔的正常肺組織20 例作為對照，均來自我院行健康檢查且診斷結(jié)果為正常的健康者。包括男12 例，女8 例；年齡35～71 歲，平均（53.2±19.1）歲。 所有研究對象均為自愿參與并簽署知情同意書，兩組性別、年齡一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫組化檢測Oct4、Sox2 的表達(dá)

用4%多聚甲醛的固定組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，常規(guī)脫蠟，用水浴法修復(fù)抗原，用3%的雙氧水抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，封閉內(nèi)源性非特異性抗原，加入Oct4、Sox2 多克隆抗體，4℃下過夜，滴加二抗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色反應(yīng)，用蘇木精復(fù)染封片。 所用抗體均購自Abcam 公司，二抗試劑盒及DAB 顯色試劑盒均購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 結(jié)果判讀及評分標(biāo)準(zhǔn)

光鏡下進(jìn)行觀測，陽性反應(yīng)：細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)有棕黃色、黃色或褐色顆粒。 依據(jù)查看到的陽性細(xì)胞所占比例及染色深淺評定陽性反應(yīng)的強(qiáng)度。觀察時按照視野中陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分：百分比≤5%為0 分，＞5%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，在＞75%以上者為4 分。按照染色強(qiáng)度進(jìn)行評分：不著色為0 分；淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。 最后按兩種評分乘積分成陰性：0～2 分；陽性：3～12 分[4-6]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sox2、Oct4 在肺癌組織及正常肺組織中的表達(dá)情況

Sox2、Oct4 在20 例正常肺組織中表達(dá)均為陰性，在60 例肺癌組織中，Sox2 陽性28 例，陽性表達(dá)率為46.7%；Oct4 陽性43 例，陽性表達(dá)率為71.7%。 與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.924，11.377；均P ＜0.05）。

2.2 肺癌組織中Sox2、Oct4 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

病理分期、病理類型與分化程度不同的肺癌組織中Sox2、Oct4 的陽性表達(dá)率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；而不同年齡、性別的肺癌組織中Sox2、Oct4 的陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

2.3 肺癌組織中Sox2 與Oct4 表達(dá)的關(guān)系

Sox2 與Oct4 在肺癌組織中的陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。 見表2。

3 討論

腫瘤的發(fā)生與很多原因有關(guān)，目前認(rèn)為，惡性腫瘤是一種干細(xì)胞疾病，源自組織成體干細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。研究證明[7]，腫瘤細(xì)胞與未分化的胚胎細(xì)胞都具無限增殖的能力、自我更新以及侵襲性，因此二者之間存在某些相似性，提示了在腫瘤細(xì)胞中也可能會出現(xiàn)某些胚胎干細(xì)胞因子。肺癌是當(dāng)今世界上對人類生命健康威脅最大的惡性腫瘤，其具有較高的發(fā)病率及死亡率，目前對疾病發(fā)生發(fā)展的探索并尋求有效的治療方法是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點。 腫瘤干細(xì)胞理論指出，腫瘤中存在一小群腫瘤的啟動細(xì)胞，它們所具備的自我更新及抵抗治療等特點是腫瘤治愈率低、治療復(fù)雜且復(fù)發(fā)性高的根源。近年來人們對干細(xì)胞的研究較為深入，越來越多學(xué)者經(jīng)研究證實了腫瘤起源于干細(xì)胞這一觀點[8]。多數(shù)學(xué)者指出，干細(xì)胞的分子印跡決定著腫瘤的預(yù)后[9]。Oct4 與Sox2 是早期胚胎發(fā)育及細(xì)胞特征維持所必須的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及消化道器官發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。 另外，這兩種因子還參與到中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸道、泌尿生殖系統(tǒng)等各類腫瘤的發(fā)展過程當(dāng)中。 它們在維持、調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞自我更新、侵襲力等特性方面均發(fā)揮著重要作用并逐漸成為研究腫瘤干細(xì)胞作用機(jī)制和防治的直接通道。為進(jìn)一步支持這些理論，研究人員對腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行了Sox2 與Oct4 基因的敲除。結(jié)果顯示，這些腫瘤啟動細(xì)胞在去除二者后失去了自我更新、無限增殖及形成腫瘤的能力，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡。 兩者的突變和異常表達(dá)與許多腫瘤有關(guān)。這些基因表達(dá)的特異性與病理類型、臨床分期、分化程度及其與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系都需要進(jìn)行進(jìn)一步研究，其結(jié)果對肺癌的早期診斷及治療有巨大的臨床意義[10]。

表1 肺癌組織中Sox2、Oct4 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（n=60，例）

表2 肺癌組織中Sox2 與Oct4 表達(dá)的關(guān)系（n = 60，例）

Sox 基因家庭最早發(fā)現(xiàn)于小鼠體內(nèi)，隨后在鳥類、魚類、哺乳類以及人類等生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量該家族的基因片段。根據(jù)染色體的組成和基因序列的相似性可以將其分為10 個亞群。在早期胚胎的形成與發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育、性別形成、腫瘤發(fā)生等重要生物學(xué)過程中，所編碼的蛋白起到不可替代的作用。該基因參與維持胚胎干細(xì)胞的多樣性并在各類器官發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，其中包括支氣管的形成。 在腫瘤基因表達(dá)的研究中，通過分析分化中激活的基因結(jié)果表明，Sox2 在低分化的腫瘤中高表達(dá)，將該因子與Oct4 等轉(zhuǎn)錄因子共同轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞后能夠建立多能分化干細(xì)胞或多能分化腫瘤細(xì)胞。許多研究指出，Sox2 主要是通過參與調(diào)解復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)以維持干細(xì)胞特性及腫瘤干細(xì)胞的抗凋亡特性[11]。因此，靶向Sox2 是治療腫瘤的良好政策。 但盡管許多針對腫瘤組織的研究報道了該因子在前列腺、乳腺癌等方面的高表達(dá)且闡明Sox2 的發(fā)生對腫瘤發(fā)生的重要性但該因子在調(diào)控腫瘤發(fā)生的作用機(jī)制尚不完全清晰。 研究指出，在人與鼠的體細(xì)胞中將該因子與Oct4 等因子轉(zhuǎn)入細(xì)胞后可使機(jī)體細(xì)胞發(fā)生多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 而該因子與OCT4/NANOG 以及LIN28 這4 個因子的公轉(zhuǎn)，可使人的體細(xì)胞發(fā)生多能干細(xì)胞化并具有胚胎干細(xì)胞的特性[12]。 ESCs 基因Oct4 也稱Oct3/4，位于染色體的6p21.31 位置。該因子屬于Ⅴ類POU 轉(zhuǎn)錄因子家族，由Pou5fl 基因碼產(chǎn)生，最初發(fā)現(xiàn)于胚胎腫瘤細(xì)胞。后來發(fā)現(xiàn)該因子的表達(dá)嚴(yán)格局限于小鼠生命周期全程或多功能細(xì)胞中。 它與Sox2 等轉(zhuǎn)錄因子能對胚胎干細(xì)胞進(jìn)行自我更新并保持胚胎干細(xì)胞的多潛能性，是生殖細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志物[13]。 目前可以確定的是，Oct4 作為公認(rèn)的胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物，在卵母細(xì)胞、胚囊的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、早期分裂期胚胎、卵圓柱期胚胎的原始生殖細(xì)胞及原始外胚層中均有表達(dá)且隨著細(xì)胞的不斷分化，其表達(dá)水平會逐漸下調(diào)，說明它能夠保持細(xì)胞發(fā)育中的多能性。 有研究顯示，Sox2 在消化道腫瘤中表達(dá)量高，該表達(dá)因子對患者腫瘤組織的存在意義為促進(jìn)細(xì)胞凋亡周期、抑制細(xì)胞生長。 而Oct4 最初發(fā)現(xiàn)于胃癌及胃潰瘍等胃部疾病患者病灶組織中，該類患者病灶組織中Oct4 表達(dá)量較高，對癌癥表達(dá)和預(yù)后密切相關(guān)，調(diào)控患者治療及預(yù)后。 肺癌的發(fā)生起源是一個多因素、多階段的過程，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。 目前已經(jīng)證明[14]，未分化的胚胎細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞都有自我更新、無限增殖的能力及侵襲性。 近年來各類研究發(fā)現(xiàn)，Oct4 可表達(dá)于造血及間充質(zhì)干細(xì)胞、胰島、外周血、腸上皮、子宮內(nèi)膜、臍帶血、肺臟、甲狀腺、腎臟及羊水和臍帶血等組織的祖細(xì)胞[15-17]。 這些結(jié)果提示，Oct4 可能在胚胎組織、成體干細(xì)胞及胚胎癌組織里表達(dá)。 目前對該因子的分子調(diào)節(jié)機(jī)制研究較少，但部分研究發(fā)現(xiàn)，相對于生殖細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞而言，該因子的表達(dá)會隨著細(xì)胞的分化而下降[18]。 實驗研究也指出，分化的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞比內(nèi)細(xì)胞群Oct 表達(dá)低30 倍，其表達(dá)水平上調(diào)與下調(diào)分別與維持細(xì)胞多能性及細(xì)胞的分化有關(guān)。胚胎干細(xì)胞內(nèi)Oct 的水平?jīng)Q定胚胎干細(xì)胞3 種不同命運(yùn)，其表達(dá)水平保持在特定水平才能使胚胎干細(xì)胞處于不斷自我更新的狀態(tài)[19]。 當(dāng)它的水平是正常的2 倍時，可分化為中胚層細(xì)胞和原始內(nèi)胚層；當(dāng)其表達(dá)水平降低至正常的1/2 時轉(zhuǎn)為滋養(yǎng)層。 因此，其表達(dá)水平需保持在較窄范圍內(nèi)以維持細(xì)胞多能性的表型。 本研究結(jié)果顯示，Sox2、Oct4 在20 例正常肺組織中表達(dá)全部為陰性，在60 例肺癌中，Sox2 陽性28例，陽性表達(dá)率為46.7%，Oct4 陽性43 例，陽性表達(dá)率為71.7%。 病理分期、病理分型與分化程度不同的患者Sox2、Oct4 的表達(dá)存在明顯差異（P ＜0.05），而不同年齡、性別的患者Sox2、Oct4 的表達(dá)無明顯差異（P ＞0.05），說明Sox2、Oct4 的表達(dá)會加速腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和分化，對腫瘤的預(yù)后有嚴(yán)重影響。 研究認(rèn)為肺癌的發(fā)生、發(fā)展與Sox2 與Oct4 密切相關(guān)，且通過協(xié)同作用共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[13]，但對Sox2 和Oct4在肺癌組織中的交叉表達(dá)分析結(jié)果顯示，兩者并無明顯相關(guān)性，由于作用機(jī)制尚未明確，尚不能排除它們之間的協(xié)同作用，需要有大量的后續(xù)研究進(jìn)一步對其進(jìn)行分析探索。

綜上所述，Sox2 與Oct4 在肺癌組織中呈明顯高水平表達(dá)，并與腫瘤的病理分型、分期及分化程度密切相關(guān)，因此Sox2、Oct4 可能在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，在肺癌的診斷及預(yù)后評價中有著重要意義。

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