余真君 湯永志 燕飛 朱敏 朱堅(jiān)勝

HBsAg對(duì)健康成人外周血單核細(xì)胞來(lái)源樹突狀細(xì)胞Tim-3信號(hào)通路的影響

余真君 湯永志 燕飛 朱敏 朱堅(jiān)勝

目的 探討HBsAg對(duì)健康成人外周血單核細(xì)胞來(lái)源樹突狀細(xì)胞（MD-DCs）的免疫活性及對(duì)T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim-3）和下游信號(hào)分子核因子-κB（NF-κB）蛋白表達(dá)的影響。方法 分離健康成人外周血單核細(xì)胞，經(jīng)GM-CSF、IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)為樹突狀細(xì)胞（DCs），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs表面標(biāo)志物表達(dá)水平。MD-DCs分4組添加不同濃度HBsAg（0、1、2、5μg/ml），分別設(shè)為對(duì)照組、+1μg/ml組、+2μg/ml組、+5μg/ml組，Western印跡法檢測(cè)Tim-3、NF-κB信號(hào)蛋白表達(dá)，細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑檢測(cè)MD-DCs刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子分泌水平。結(jié)果 外周血來(lái)源單核細(xì)胞成功誘導(dǎo)分化為DCs。與對(duì)照組相比，+2μg/ml及+5μg/ml組MD-DCs Tim-3及NF-κB表達(dá)水平均上調(diào)，刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖能力均增強(qiáng)，炎癥因子IL-6、IL-10、IFN-γ分泌水平均增高（均P＜0.05），而+1μg/ml組較對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。與其他3組相比，+5μg/ml組MD-DCs Tim-3、NF-κB、炎癥因子分泌水平增高，刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（均P＜0.05）。結(jié)論 HBsAg上調(diào)MD-DCs Tim-3及NF-κB表達(dá)水平，增強(qiáng)MD-DCs免疫活性，且刺激作用隨HBsAg濃度的增高而增強(qiáng)。

樹突狀細(xì)胞 肝炎表面抗原，乙型 T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3 核因子-κB

【 Key words】 Dendritic cells Hepatitis B virus surface antigen T cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecules-3 Nuclear factor-κB

HBV感染是世界范圍內(nèi)最常見的慢性病毒感染性疾病，與肝癌、肝硬化的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[1]，目前約3.5億人口罹患慢性HBV感染[2]，至今仍是全球健康衛(wèi)生的難題。HBV并不直接造成機(jī)體細(xì)胞損壞，但可激活固有及獲得性免疫反應(yīng)，通過(guò)破壞或者紊亂機(jī)體的免疫功能，尤其是針對(duì)HBV的特異性抗病毒免疫功能，使得HBV逃避機(jī)體免疫攻擊，進(jìn)而形成持續(xù)感染[3]。樹突狀細(xì)胞（DCs）是體內(nèi)強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，是溝通固有免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)的橋梁[4]，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要組成部分[5]。很多數(shù)據(jù)表明慢性HBV感染患者DCs等細(xì)胞免疫功能障礙[6]，最新研究表明新生兒感染HBV后更易轉(zhuǎn)為慢性感染可能為臍帶血中髓系DCs、漿細(xì)胞樣DCs濃度較低所致[7]。本研究采用健康成人外周血單核細(xì)胞來(lái)源樹突狀細(xì)胞（MD-DCs），加入HBsAg體外刺激，探討HBsAg對(duì)MD-DCs免疫功能及T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim-3）及下游信號(hào)分子核因子-κB（NF-κB）表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 重組人粒系-巨系細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重組人白細(xì)胞介素-4（rhIL-4）均購(gòu)于美國(guó)R&D公司；抗人CD11c-APC、抗人PerCP-HLA-DR、抗人CD80-PE、抗人CD86-FITC及同型對(duì)照均購(gòu)于美國(guó)Ebioscience公司；重組人HBsAg購(gòu)于以色列Prospec公司；Tim-3一抗購(gòu)于美國(guó)BioVision公司；NF-κB一抗、GAPDH一抗、羊抗兔二抗均購(gòu)于美國(guó)Epitomics公司；細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑（MTS-PMS）購(gòu)于美國(guó)Promega公司；IL-6、IL-10、IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于美國(guó)R&D公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于上海華精生物高科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MD-DCs體外誘導(dǎo)分化及流式鑒定 4h內(nèi)采集的健康成人志愿者外周血100～200ml（所有志愿者身體狀況均符合國(guó)家規(guī)定的體檢要求，并在采血前均已簽署知情同意書），經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法獲得外周血單核細(xì)胞（PBMC），將PBMC分別加入至6孔板，每孔添加RPMI-1640培養(yǎng)基2ml重懸，培養(yǎng)箱中孵育2h，吸棄上清液并用4℃預(yù)冷PBS沖洗3次，獲得貼壁的單核細(xì)胞。每孔加入含20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基2ml，然后添加細(xì)胞因子（終濃度分別為rhGM-CSF 750U/ml、rhIL-4 800U/ml）培養(yǎng)，隔天半量換液，并補(bǔ)充細(xì)胞因子。培養(yǎng)至第7天，收集懸浮細(xì)胞，各加入流式標(biāo)記抗體CD11c、HLA-DR、CD80、CD86及同型對(duì)照免疫標(biāo)記，流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)各細(xì)胞表型表達(dá)水平；并將細(xì)胞分為4組，分別不添加HB－sAg（對(duì)照組）、添加HBsAg 1μg/ml（+1μg/ml組）、添加HBsAg 2μg/ml（+2μg/ml組）、添加HBsAg 5μg/ml（+5μg/ ml組）（每組3孔），培養(yǎng)至第9天后收集懸浮細(xì)胞。

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)MD-DCs形態(tài)學(xué)觀察所見（a：光鏡下，×400；b：電鏡下，×3 820）

1.2.2 Western印跡 收集各組懸浮細(xì)胞抽提蛋白，每孔總蛋白40μg上樣，一抗（Tim-3、NF-κB、GAPDH）均1∶1 000孵4℃過(guò)夜，羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育2h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色，Quantlty One軟件灰度值分析。

1.2.3 同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 將已收集的4組懸浮細(xì)胞加入絲裂霉素C（25μg/ml）處理30min，離心、棄上清液，加入含20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸作為刺激細(xì)胞；刺激細(xì)胞與另一健康志愿者來(lái)源的淋巴細(xì)胞按不同比例（效靶比1∶5、1∶10、1∶20）加入96孔板，共培養(yǎng)96h；培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入MTS-PMS 20μl/孔，孵育4h，檢測(cè)其吸光度（A）值。+1μg/ml組刺激指數(shù)（SI）=（+1μg/ml組A-本底A）/（對(duì)照組A-本底A）；其它組SI計(jì)算方法依此類推；SI數(shù)值越大代表DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.2.4 ELISA 收集各組細(xì)胞上清液，ELISA法檢測(cè)炎癥因子IL-6、IL-10、IFN-γ分泌水平，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品450nm處A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并換算對(duì)應(yīng)細(xì)胞因子的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)MD-DCs形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 見圖1、表1。

由圖1可見，PBMC培養(yǎng)至第7天時(shí)，細(xì)胞聚集形成集落，多呈懸浮狀態(tài)，電鏡下可見細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞表面有毛刺，呈典型DCs形態(tài)。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)MD-DCs流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型陽(yáng)性率（%）

由表1可見，收集懸浮細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDDCs特異性細(xì)胞表型CD11c、HLA-DR以及DCs成熟度細(xì)胞表型CD80、CD86，結(jié)果顯示這些細(xì)胞表型陽(yáng)性率均明顯增高（均P＜0.01）；這表明單核細(xì)胞在加入rhGMCSF、rhIL-4共培養(yǎng)后，已成功誘導(dǎo)分化為MD-DCs。

2.2 各組MD-DCs Tim-3、NF-κB信號(hào)蛋白表達(dá)水平比較 見表2。

表2 各組MD-DCs Tim-3、NF-κB信號(hào)蛋白表達(dá)水平比較

由表2可見，與對(duì)照組比較，+2μg/ml、+5μg/ml組MD-DCs Tim-3（t=2.28、6.31，均P＜0.05）及NF-κB（t= 4.27、6.69，均P＜0.01）表達(dá)水平均增高，而+1μg/ml組信號(hào)蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯增高或降低（均P＞0.05）。與+1μg/ml組比較，+2μg/ml組MD-DCs Tim-3（t=2.68，P＜0.05）、NF-κB（t=4.98，P＜0.01）表達(dá)水平均增高。與+1μg/ml、+2μg/ml組比較，+5μg/ml組MD-DCs Tim-3（t=6.71、4.02，均P＜0.01）及NF-κB（t=7.40、2.42，均P＜0.05）表達(dá)水平均上調(diào)。

2.3 各組MD-DCs對(duì)淋巴細(xì)胞SI比較 見表3。

表3 各組MD-DCs對(duì)淋巴細(xì)胞SI比較

由表3可見，在效靶比1∶5情況下，+1μg/ml組MD-DCs對(duì)淋巴細(xì)胞SI與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=1.12，P＞0.05）；+2μg/ml組在效靶比1∶5情況下，其SI較+1μg/ml、對(duì)照組明顯增高（t=6.62、7.75，均P＜ 0.01）；+5μg/ml組在效靶比1∶5、1∶10情況下，SI較+ 1μg/ml、+2μg/ml、對(duì)照組均增高（t=9.56、2.94、10.68、6.50、2.84、6.01，均P＜0.05）。

2.4 各組MD-DCs炎癥因子分泌水平比較 見表4。

表4 各組MD-DCs炎癥因子分泌水平比較（pg/ml）

由表4可見，與對(duì)照組比較，+2μg/ml、+5μg/ml組炎癥因子IL-6（t=3.88、6.61，均P＜0.01）、IL-10（t=4.13、6.41，均P＜0.01）、IFN-γ（t=5.77、13.05，均P＜0.01）濃度均明顯增高，+1μg/ml組炎癥因子分泌水平無(wú)明顯增高或降低（均P＞0.05）。與+1μg/ml組比較，+2μg/ml組IL-6（t=3.49，P＜0.01）、IL-10（t=4.50，P＜0.01）、IFN-γ（t=5.39，P＜0.01）升高。與+1μg/ml、+2μg/ml組比較，+ 5μg/ml組IL-6（t=6.21、2.73，均P＜0.05）、IL-10（t= 6.97、2.28，均P＜0.05）、IFN-γ（t=12.67、7.27，均P＜0.01）分泌水平均上調(diào)。

3 討論

Tim-3與多種疾病如病毒感染、腫瘤、自身免疫疾病、過(guò)敏反應(yīng)、移植免疫排斥反應(yīng)等的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[8]。Tim-3 mRNA最初發(fā)現(xiàn)高表達(dá)于人輔助性T細(xì)胞1（Th1），Tim-3被認(rèn)為是Th1細(xì)胞特異表達(dá)的膜蛋白；后來(lái)越來(lái)越多的研究表明，CD8+T細(xì)胞、Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、DCs、肥大細(xì)胞等表面均可發(fā)現(xiàn)Tim-3表達(dá)[8]，最新研究發(fā)現(xiàn)Tim-3也表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，并可能為腫瘤患者的獨(dú)立預(yù)后因素[9]。Tim-3與其配體半乳糖凝甘素-9（Gal-9）結(jié)合可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣流出，致使Th1細(xì)胞聚合、死亡，下調(diào)Th1免疫反應(yīng)、誘導(dǎo)免疫耐受，抑制獲得性免疫反應(yīng)。然而在固有免疫反應(yīng)中，Tim-3可能因?yàn)樗幟庖攮h(huán)境的變化，促進(jìn)或者抑制免疫反應(yīng)；例如Anderson等[10]研究表明抗原遞呈細(xì)胞表面Tim-3可協(xié)同Toll樣受體（TLRs）促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的分泌，而Chiba等[11]發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)DCs過(guò)表達(dá)的Tim-3抑制核酸介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)。

Tim-3信號(hào)分子在HBV感染的發(fā)病機(jī)制中起重要的免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血單核細(xì)胞、循環(huán)NK細(xì)胞、CD4+/CD8+T細(xì)胞上Tim-3信號(hào)蛋白表達(dá)水平較健康成人對(duì)照組均明顯增高，阻斷Tim-3信號(hào)通路可部分恢復(fù)NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等的免疫功能[12-13]，充分說(shuō)明了過(guò)表達(dá)的Tim-3與CHB患者免疫功能障礙密切相關(guān)。CHB患者DCs免疫功能障礙，不能有效地提呈抗原給T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體無(wú)法產(chǎn)生有效的抗病毒免疫反應(yīng)是HBV持續(xù)感染的重要原因。HBV感染患者血液循環(huán)內(nèi)存在大量HBV病毒微粒和病毒蛋白，尤其是HBsAg，病毒或病毒蛋白與DCs之間存在多元免疫反應(yīng)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)HBsAg體外刺激MD-DCs可上調(diào)Tim-3、NF-κB信號(hào)蛋白表達(dá)水平，增強(qiáng)其刺激淋巴細(xì)胞增殖能力和炎癥因子IL-6、IL-10、IFN-γ等分泌水平，即HBsAg體外刺激增強(qiáng)MD-DCs免疫活性，且其刺激作用與HBsAg濃度相關(guān)；與本文研究結(jié)論相符。Jan等[15]發(fā)現(xiàn)HBsAg體外刺激MD-DCs,細(xì)胞表型CD80、CD83、CD86表達(dá)水平上調(diào)，可通過(guò)NF-κB、p38 MAPK信號(hào)通路促進(jìn)IL-12、IL-10等炎癥因子分泌。

在本研究中，HBsAg體外刺激MD-DCs，Tim-3表達(dá)水平上調(diào)，與MD-DCs免疫活性正性相關(guān)；且隨著HBsAg刺激濃度升高，Tim-3表達(dá)水平亦相應(yīng)上調(diào)。然而既往研究多表明高水平表達(dá)的Tim-3與CHB患者免疫細(xì)胞功能障礙相關(guān)，結(jié)合Tim-3信號(hào)分子在固有免疫反應(yīng)中的雙重調(diào)節(jié)作用，我們可以推測(cè)不同免疫環(huán)境下Tim-3扮演的角色也不同；例如有研究數(shù)據(jù)證實(shí)腫瘤患者體內(nèi)高表達(dá)的Tim-3可能致患者DCs免疫功能障礙[11]，也有研究發(fā)現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)中DCs表面Tim-3信號(hào)蛋白過(guò)表達(dá)并促進(jìn)免疫應(yīng)答反應(yīng)[10]。慢性HBV感染者體內(nèi)免疫內(nèi)環(huán)境與體外單純HBsAg刺激免疫環(huán)境之間的巨大差異，或許導(dǎo)致了Tim-3信號(hào)蛋白截然不同的免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，體外環(huán)境下HBsAg上調(diào)MD-DCs細(xì)胞Tim-3及下游信號(hào)分子NF-κB蛋白表達(dá)水平，增強(qiáng)MD-DCs細(xì)胞免疫活性，且刺激作用隨HBsAg濃度的增高而增強(qiáng)。CHB患者體內(nèi)免疫環(huán)境下Tim-3對(duì)DCs免疫功能的調(diào)節(jié)作用，以及Tim-3對(duì)MD-DCs功能調(diào)節(jié)的確切機(jī)制均待進(jìn)一步的研究。

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Effects of hepatitis B virus surface antigen on Tim-3 signaling pathway of dendritic cells

YU Zhenjun,TANG Yongzhi,YAN Fei,et al.
Department of Infectious Diseases,Affiliated Taizhou Hospital of Wenzhou Medical University,Linhai 317000,China

Objective To investigate the effect of hepatitis B virus surface antigen(HBsAg)on the expression of T cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecules-3(Tim-3)and the downstream signal molecule Nuclear Factor-κB (NF-κB)of human monocyte-derived dendritic cells(MD-DCs). Methods Monocytes obtained from normal adult peripheral blood were co-cultured with GM-CSF and IL-4 to induce to dendritic cells,the cell phenotypes expressions on MD-DCs were detected by flow cytometry.Different concentrations of HBsAg(0,1μg/ml,2μg/ml,5μg/ml)were added in the culture medium.The expressions of signaling proteins were determined by Western blotting assay,the lymphocytes-stimulatory capacity of MD-DCs was determined with a proliferation and cytotoxicity detection kit(MTS),and the concentrations of cytokines in the supernatant were determined by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA). Results Monocytes were successfully induced to dendritic cells.Compared with the control group,the expressions of signaling proteins Tim-3 and NF-κB of the HBsAg(2μg/ml or 5μg/ml) stimulation group were both up-regulated,the lymphocytes-stimulation capacity was enhanced,and the secretion levels of IL-6, IL-10 and IFN-γ were increased(P＜0.05),while there was no significant difference between 1μg/ml HBsAg stimulation group and control group.Compared with the other three groups,the treatment with 5μg/ml HBsAg led to increased expressions of Tim-3,NF-κB and cytokines,and enhanced lymphocytes-stimulation capacity of MD-DCs(P＜0.05). Conclusion HBsAg stimulation can increase the expressions of Tim-3 and downstream signaling molecule NF-κB of MD-DCs,and enhance the immune function of MD-DCs in a dose-dependent manner.

2015-02-13）

（本文編輯：李媚）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金計(jì)劃項(xiàng)目（2010KYB125）

317000 臨海，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院感染科（余真君、湯永志、燕飛、朱堅(jiān)勝），公共科研平臺(tái)（朱敏）

朱堅(jiān)勝，E-mail：zhujs@enzemed.com