鄧妙 劉元偉 張紅艷 岑加萍 張治芬

●論 著

鈣蛋白酶-10基因SNP-19與多囊卵巢綜合征相關(guān)性研究

鄧妙 劉元偉 張紅艷 岑加萍 張治芬

目的 探討鈣蛋白酶-10基因（CAPN-10）單核苷酸多態(tài)性-19（SNP-19）與多囊卵巢綜合征（PCOS）的相關(guān)性。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)，對107例PCOS患者（PCOS組）及111例健康體檢者（對照組）的CAPN-10 SNP-19進行分析，并測定其性激素和生化指標(biāo)。PCOS組再根據(jù)BMI與胰島素抵抗（IR）穩(wěn)態(tài)模型指數(shù)（HOMA-IR）分為肥胖組與非肥胖組、IR組與非IR組，分析CAPN-10 SNP-19與其關(guān)系。結(jié)果 與對照組相比，PCOS組BMI、空腹血糖（FPG）、TG、TC、LDL、黃體生成素（LH）、黃體生成素/卵泡刺激素（LH/FSH）、睪酮（T）均升高（均P＜0.01）。PCOS組CAPN-10 SNP-19 1等位基因及1/2基因型頻率均高于對照組（均P＜0.05）；且CAPN-10 SNP-19 1/2基因型PCOS發(fā)病風(fēng)險較1/1、2/2基因型增加約2倍（OR=1.9，95%CI=1.1～3.3，P＜0.05）。CAPN-10 SNP-19 1、2等位基因頻率PCOS肥胖組與非肥胖組、IR組與非IR組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）；PCOS肥胖組和IR組CAPN-10 SNP-19 1/2基因型頻率分別高于非肥胖組和非IR組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論 CAPN-10 SNP-19與PCOS遺傳易感性有關(guān)，可能與PCOS肥胖及IR無關(guān)。

多囊卵巢綜合征 半胱氨酸內(nèi)肽酶類，鈣蛋白酶-10 多態(tài)性，單核苷酸 胰島素抵抗

【 Abstract】 Objective To investigate the relationship between single nucleotide polymorphisms-19(SNP-19)in calpain-10 (CAPN-10)gene and polycystic ovary syndrome(PCOS). Methods One hundred and seven PCOS patients(PCOS group)and 111 healthy female subjects(control group)were recruited in the study.The distribution of CAPN-10 SNP-19 was analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).Serum hormones and biochemical indicators were also measured.Oral glucose tolerance test(OGTT)was performed in PCOS group. Results The BMI,FPG,TG, TC,LDL,LH,LH/FSH and T levels were significantly increased in PCOS group compared to control group(P＜0.01).The frequency of allele 1 and genotype 1/2 of CAPN-10 SNP-19 were higher in PCOS group than those in control group.Genotype 1/2 was closely associated with PCOS compared to 1/1 and 2/2(OR=1.9,95%CI=1.1-3.3,P＜0.05).There was no significant difference in frequency of genotype 1/2 between obese group and non-obese group,between insulin resistance(IR)group and non-IR group of PCOS patients(P＞0.05). Conclusion The SNP-19 in CAPN-10 may contribute to the genetic susceptibility to PCOS,but it may be not correlate with obesity or IR of PCOS patients.

【 Key words】 Polycystic ovary syndrome Cysteine endopeptidases,CAPN-10 Polymorphism,single nucleotide Insulin resistance

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是女性常見的內(nèi)分泌疾病，影響女性從青春期到絕經(jīng)后整個過程的身心健康。其發(fā)病機制尚不十分清楚，但大部分研究認(rèn)為胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是PCOS病理生理的中心環(huán)節(jié)，約65%的PCOS患者存在IR[1]。鈣蛋白酶-10基因（CAPN-10）是第1個被克隆定位的與2型糖尿?。═2DM）有關(guān)的基因，該基因的變異與IR的發(fā)生密切相關(guān)[2]。隨后大量研究也證實CAPN-10與多種IR相關(guān)性疾病，如妊娠期糖尿病（GDM）、肥胖癥、高血壓等有關(guān)[3-5]。因為PCOS與T2DM、GDM等有共同的IR機制，所以CAPN-10也成為PCOS的重要候選基因。本研究旨在探討CAPN-10單核苷酸多態(tài)性-19（single nucleotide polymorphisms-19，SNP-19）與PCOS的相關(guān)性，為PCOS發(fā)病的遺傳因素、分子機制、臨床診斷和基因治療提供可能的實驗依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2013年1月至2014年1月在杭州市第一人民醫(yī)院婦科就診的PCOS患者設(shè)為PCOS組；納入標(biāo)準(zhǔn)：近3個月未服用避孕藥或其他影響性激素水平及糖脂代謝的藥物；診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2003年ESHRE/ASRM鹿特丹會議標(biāo)準(zhǔn)[6]。另以隨機數(shù)字表法選取同期來本院體檢的健康女性設(shè)為對照組；納入標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)周期規(guī)律，無高雄激素血癥及高雄激素表現(xiàn)，經(jīng)陰道B超檢查卵巢無多囊樣改變；近3個月未服用避孕藥或其他影響性激素水平及糖脂代謝的藥物，并排除甲狀腺、腎上腺等內(nèi)分泌疾病。PCOS組共107例，年齡18～34（26.7± 4.8）歲。對照組共111例，年齡21～36（27.1±4.2）歲。兩組受檢者年齡比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；均于月經(jīng)第2～4天或PCOS組患者閉經(jīng)期B超檢查未見優(yōu)勢卵泡時，禁食12h后清晨空腹采靜脈血進行生化指標(biāo)（TG、TC、HDL、LDL）、性激素[卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）、催乳素（PRL）、睪酮（T）]測定和基因檢測。PCOS組當(dāng)日行糖耐量試驗（OGTT）：75g葡萄糖溶于250ml水中，3min內(nèi)服下，空腹及服糖后2h分別采血測定血糖、胰島素水平。兩組受檢者采血當(dāng)日測量身高、體重，計算BMI、胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)模型指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR=[空腹血糖（FPG，mmol/L）×空腹胰島素（mIU/L）]/22.5。PCOS組再根據(jù)HOMA-IR分為IR組（HOMA-IR≥2.0，76例）和非IR組（HOMA-IR＜2.0，31例）；根據(jù)BMI分為肥胖組（BMI≥25，29例）和非肥胖組（BMI＜25，78例）。

1.2 方法

1.2.1 性激素及生化指標(biāo)測定 性激素測定采用化學(xué)發(fā)光法（德國西門子ADVIA-centaur XP全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑）；血糖及血脂測定采用酶法（美國貝克曼-庫爾特AU5800全自動生化分析儀及配套試劑）；胰島素測定采用電化學(xué)發(fā)光法（瑞士羅氏ebol電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑）。

1.2.2 CAPN-10 SNP-19基因型檢測 美國AXYGEN DNA提取試劑盒提取外周血有核細(xì)胞中的基因組DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）檢測技術(shù)（美國Applied Biosystems-2720 PCR儀）。引物序列：上游引物 5′-GTTTGGTTCTCTTCAGCGTGGAG-3′，下游引物5′-CATGAACCCTGGCAGGGTCTAAG-3′；反應(yīng)體系：25μl反應(yīng)體系，1×PCR緩沖液（含Mg2+）12.5μl，2mmol/L dNTPs 2.5μl，5μmol/L上下游引物各1μl，5U/μl Taq酶0.25μl，基因組DNA 2μl，加注射用水至總體積25μl；循環(huán)條件：預(yù)變性95℃，5min；變性95℃，30s；退火58℃，30s；延伸72℃，30s；終止72℃，10min；共40個循環(huán)；PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳80V，60min跑膠；UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照存圖，在155bp處出現(xiàn)條帶為缺失多態(tài)（del），等位基因記為1，在187bp處出現(xiàn)條帶為插入多態(tài)（ins），等位基因記為2。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；檢測兩組等位基因頻率在群體中的代表性采用Hardy-Weinberg平衡檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PCOS組與對照組BMI及生化指標(biāo)比較 見表1。

表1 PCOS組與對照組BMI及生化指標(biāo)比較

由表1可見，與對照組相比，PCOS組除HDL外BMI、FPG、TG、TC、LDL均升高（均P＜0.01）。

2.2 PCOS組與對照組性激素指標(biāo)比較 見表2。

表2 PCOS組與對照組性激素指標(biāo)比較

由表2可見，與對照組相比，PCOS組LH、LH/FSH、T均升高（均P＜0.01）；兩組FSH、E2、P、PRL水平均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。

2.3 PCOS組中肥胖組與非肥胖組血糖、胰島素水平及HOMA-IR比較 見表3。

表3 PCOS組中肥胖組與非肥胖組血糖、胰島素水平及HOMA-IR比較

由表3可見，與非肥胖組相比，肥胖組空腹胰島素、HOMA-IR均顯著升高（均P＜0.01）；兩組FPG、服糖后2h血糖、服糖后2h胰島素水平均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。

2.4 PCOS組中肥胖組與非肥胖組性激素指標(biāo)比較 見表4。

由表4可見，與非肥胖組相比，肥胖組LH升高（P＜0.05）；LH/FSH及T也升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；兩組FSH、E2、P、PRL水平均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。

2.5 CAPN-10 SNP-10 3種基因型電泳結(jié)果 見圖1。

表4 PCOS組中肥胖組與非肥胖組性激素指標(biāo)比較

圖1 CAPN-10 SNP-19 3種基因型電泳結(jié)果（marker：標(biāo)志物；1/1：155bp片段純合子；2/2：187bp片段純合子；1/2：155/187bp片段雜合子）

由圖1可見，本研究共檢測到CAPN-10 SNP-19 1/1、1/2、2/2這3種基因型。

2.6 PCOS組與對照組CAPN-10 SNP-19等位基因及基因型頻率比較 見表5。

表5 PCOS組與對照組CAPN-10 SNP-19等位基因及基因型頻率比較[例（%）]

由表5可見，PCOS組CAPN-10 SNP-19 1等位基因、1/2基因型頻率均高于對照組（均P＜0.05）。且PCOS組、對照組CAPN-10 SNP-19基因型頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡法則（χ2=0.84、1.32，均P＞0.05）；CAPN-10 SNP-19 1/2基因型PCOS發(fā)病風(fēng)險較1/1、2/2基因型增加約2倍（OR=1.9，95%CI=1.1～3.3，P＜0.05）。

2.7 PCOS組中肥胖組與非肥胖組、IR組與非IR組CAPN-10 SNP-19等位基因、基因型頻率比較 見表6。

表6 PCOS組中肥胖組與非肥胖組、IR組與非IR組CAPN-10 SNP-19等位基因、基因型頻率比較[例（%）]

由表6可見，CAPN-10 SNP-19 1、2等位基因頻率在肥胖組與非肥胖組、IR組與非IR組均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）；肥胖組和IR組1/2基因型頻率分別高于非肥胖組和非IR組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

CAPN-10位于稱為非胰島素依賴型糖尿病1的染色體2q37.3中，該基因全長31 kb，含有15個外顯子和14個內(nèi)含子。Turner等[2]研究發(fā)現(xiàn)CAPN-10 mRNA除心臟外，在胰島表達(dá)水平最高，提示CAPN-10對內(nèi)分泌功能有影響。CAPN-10編碼的蛋白酶屬于Ca2+依賴性非溶酶體半胱氨酸蛋白酶家族，通過激活及自溶而表現(xiàn)出蛋白水解酶活性，水解在Ca2+調(diào)節(jié)信號途徑中起重要作用的其他蛋白酶，從而參與細(xì)胞骨架調(diào)整、酶的修飾及多種細(xì)胞過程。目前SNP數(shù)據(jù)庫已列出521個人類CAPN-10 SNP位點。在眾多位點中，對SNP-19、-22、-43、-44、-56、-58、-63和-110的研究較多。其中SNP-19位于內(nèi)含子6nt7919、rs3842570，是32 bp的2次或3次重復(fù)多態(tài)。Hachisu等[7]研究顯示串聯(lián)重復(fù)序列的數(shù)目在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用，可影響mRNA的穩(wěn)定性，并通過改變結(jié)構(gòu)修飾的蛋白質(zhì)活性，從而發(fā)揮病理生理作用。

本研究結(jié)果顯示PCOS組CAPN-10 SNP-19 1等位基因及1/2基因型頻率高于對照組（均P＜0.05），且1/2基因型PCOS發(fā)病風(fēng)險較1/1、2/2基因型增加約2倍。這提示CAPN-10 SNP-19與PCOS遺傳易感性有關(guān)，是PCOS的易感基因。這與Gonzalez等[8]對西班牙PCOS患者的研究結(jié)果一致。而Dasgupta等[9]對印度南部地區(qū)PCOS患者的相關(guān)研究則表明，CAPN-10 SNP-19等位基因頻率及基因型分布與PCOS無明顯相關(guān)性。Vollmert等[10]對德國PCOS患者的研究表明SNP-19 2/2基因型與PCOS發(fā)病風(fēng)險相關(guān)（OR=2.98）。本研究進一步統(tǒng)計了不同人種PCOS組CAPN-10 SNP-19次要等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)中國浙江地區(qū)PCOS患者次要等位基因頻率1（40.2%）與西班牙PCOS患者（34.0%）[8]相近，但低于印度（54.0%）[9]、高于德國（29.0%）[10]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。這提示CAPN-10 SNP-19等位基因分布存在種族和地域的差異。

本研究顯示與對照組相比，PCOS組BMI、FPG、TG、TC、LDL均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。27.1%的PCOS患者存在肥胖，71.0%存在IR，且PCOS肥胖組較非肥胖組空腹胰島素、HOMA-IR均顯著升高（均P＜0.01）。研究表明，高胰島素水平可誘導(dǎo)肥胖相關(guān)基因表達(dá)[11]，影響脂肪細(xì)胞分化，同時刺激食欲，從而引起肥胖；而肥胖者，游離脂肪酸、乳酸鹽等代謝產(chǎn)物利用率增加又影響胰島素的分泌、代謝及靶器官的敏感性，從而加重IR，形成惡性循環(huán)。肥胖及IR近期可影響PCOS患者促排卵效果及妊娠結(jié)局，遠(yuǎn)期可增加T2DM、心腦血管疾病風(fēng)險。因此對PCOS合并肥胖患者，控制體重仍為首選的最基本的治療方案。

進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，PCOS肥胖組和IR組1/2基因型頻率分別高于非肥胖組和非IR組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。究其原因可能有：（1）本研究采用HOMA-IR作為IR的評估標(biāo)準(zhǔn)，今后需要進一步測定服糖后1h血糖、胰島素，根據(jù)曲線下面積、是否存在高峰延遲等綜合評估IR，必要時完善高胰島素正葡萄糖鉗夾術(shù)（IR的金標(biāo)準(zhǔn)）。以BMI評估肥胖，今后需完善腰圍、臀圍、腰臀比等綜合評估肥胖，并明確肥胖類型；（2）本研究中71.0%PCOS患者存在IR，非IR組僅31例，需要增加樣本量以明確CAPN-10 SNP-19與PCOS IR的關(guān)系；（3）CAPN-10 SNP-19可能與PCOS肥胖及IR有關(guān)，但其相關(guān)性被CAPN-10內(nèi)部影響CAPN-10轉(zhuǎn)錄活性的其他單核苷酸所改變。因此，今后有必要研究CAPN-10其他SNP、單倍型及單倍型組合與PCOS的相關(guān)性；（4）CAPN-10 SNP-19可改變結(jié)構(gòu)修飾的蛋白質(zhì)活性，SNP-19不同基因型的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)、組織分布及生物活性與PCOS肥胖和IR的關(guān)系有待進一步基因功能研究。

綜上所述，CAPN-10 SNP-19與PCOS遺傳易感性有關(guān)，是PCOS的易感基因。今后有必要進一步完善相關(guān)臨床資料，擴大樣本含量，綜合研究CAPN-10 SNPs、單倍型及單倍型組合與PCOS發(fā)病風(fēng)險、PCOS各臨床表型及高危型PCOS的相關(guān)性，進而進行基因功能研究，探討PCOS發(fā)病的遺傳因素和分子機制，為臨床診斷、預(yù)防和基因治療提供理論依據(jù)。

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Association of CAPN-10 SNP-19 with polycystic ovary syndrome

DENG Miao,LIU Yuanwei,ZHANG Hongyan,et al.
Department of Gynecology and Obstetrics，Hangzhou First People′s Hospital，Hangzhou 310006,China

2014-07-03）

（本文編輯：李媚）

浙江省科技計劃項目（2009C33114）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科（鄧妙現(xiàn)在杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院工作）

張治芬，E-mail：zhangzf@zju.edu.cn